От оргазма до бессмертия. Записки драг-дизайнера

Аминокислоты и пептиды

До сих пор слово «пептиды» использовалось просто как обозначение одного из многих классов молекул-биорегуляторов — примерно так же, как мы говорим «собака», увидев симпатичное животное, дружелюбно помахивающее хвостом. Однако эксперт-собаковед не согласился бы с таким упрощенным подходом ко всему собачьему племени в целом. Ведь несмотря на то, что все собаки — родственники и относятся к одному и тому же виду Canis familiaris в зоологической классификации, их свойства могут быть совершенно различными.

Для химика аминокислоты, пептиды и белки — тоже родственники, и очень близкие. Их молекулы состоят всего из пяти типов атомов: углерода (С), азота (N), кислорода (О), водорода (Н) и, значительно реже, серы (S). Пептиды и белки представляют собой полимеры, то есть цепочки из нескольких мономерных единиц — как раз эти единицы и называются аминокислотами.

Пептиды, функционирующие в организме, построены, как правило, лишь из вполне определенных аминокислот вида:

Когда аминокислоты соединяются в цепочку (это происходит с выделением молекул воды), образуется типичный пептид:

Элемент CONH, называемый пептидной группой, или пептидной связью, повторяясь, образует остов молекулы (в дословном переводе с английского backbone — «костяк, скелет»), а различные типы атомных группировок, ответвляющиеся от остова и условно обозначенные буквами R₁, R₂, R₃, R₄... Rn называются боковыми цепями. Каждая боковая цепь имеет свою индивидуальность: в целом пептидная цепочка напоминает модные в свое время ожерелья из разноцветных и разнокалиберных кусочков пластмассы — тем более что молекула пептида иногда бывает замкнута в кольцо.

Разнообразие аминокислот, из которых образуются природные пептиды, не так уж велико: подавляющее большинство пептидов состоит всего из двадцати типов мономеров. Инструкция по включению в пептидную цепь именно этих двадцати аминокислот записана в молекулах нуклеиновых кислот, обеспечивающих передачу всей генетической информации об организме от поколения к поколению.

Нуклеиновые кислоты представляют собой, как уже говорилось, очень длинные полимеры, построенные из мономеров нуклеотидов. В свою очередь, нуклеотиды состоят из оснований, присоединенных к сахарам одного из двух типов — рибозы и дезоксирибозы. Именно сахара образуют полимерную цепочку — или из рибозы (рибонуклеиновая кислота, РНК), или из дезоксирибозы (дезоксирибонуклеиновая кислота, ДНК). Особые биохимические механизмы «прочитывают» каждые три нуклеотида, стоящие подряд в цепочке ДНК, и воспринимают эту информацию как приказ либо начать синтез белковой молекулы, либо выбрать из запасов организма какую-либо аминокислоту, либо завершить синтез. Соответствие между тройками нуклеотидов и выбираемыми аминокислотами устанавливает генетический код, открытие которого до сих пор можно смело считать самым большим достижением молекулярной биологии. А правилами этого кода предусмотрен выбор только упомянутых выше двадцати аминокислот.

Правда, в природных пептидах и белках иногда встречаются и другие аминокислоты. Но они, как говорят на молекулярно-биологическом жаргоне, не кодируются, а получаются в организме из аминокислот, уже включенных в состав пептидных молекул.

Такое сверхкороткое описание сложнейшей проблемы, официально называемой ни много ни мало «центральной догмой молекулярной биологии», может создать впечатление, что ее решение далось легко и просто. На самом же деле это потребовало многих лет труда, сотен, если не тысяч, изощренных экспериментов и немалых чисто человеческих разочарований, ибо об устройстве, например, генетического кода были выдвинуты десятки остроумнейших гипотез, а уцелела в результате лишь одна.

К тому же превращение этой гипотезы в общепризнанную (на уровне Нобелевской премии) теорию немедленно выдвинуло новую проблему: почему данная тройка нуклеотидов означает выбор именно данной аминокислоты? И тогда пришлось ставить новые эксперименты, придумывать новые гипотезы и так далее. Иными словами, в науке удачный ответ — это только повод для новых вопросов, и в этом смысле творческая жизнь научных работников отличается от бега белки в колесе лишь возможностью в случае успеха расширить размеры колеса.

Пептиды и белки

Итак, пептиды — это цепочки аминокислот, выстроенные в ряд (его еще называют аминокислотной последовательностью). Зная, как организованы пептиды, мы тем самым знаем и химическую структуру белков, веществ, выполняющих в организме множество чрезвычайно важных функций — от обеспечения правильного течения биохимических реакций (например, большинство ферментов — белки) до использования в качестве строительного материала. По представлениям химика, белки — это точно такие же цепочки из тех же двадцати типов аминокислот остатков, но гораздо большей длины, чем пептиды. Обычно считается, что цепочка размерами где-то не более пятидесяти аминокислот — это еще пептид, а сверх того — уже белок.

Если бы эта книга писалась в советскую эпоху, в раздел о белках пришлось бы вставить обязательную цитату из классика марксизма-ленинизма Фридриха Энгельса: «Жизнь есть способ существования белковых тел». Иначе бдительный редактор остановил бы продвижение рукописи по издательскому конвейеру — продемонстрировать знание трудов основоположников было необходимо. В наши дни над их сочинениями принято скорее посмеиваться — а между тем это глубокое высказывание заслуживает внимания и сейчас, через сто с лишним лет после того, как была написана работа Энгельса «Диалектика природы».

Получение химически чистого пептида небольшой длины — пять, шесть, восемь аминокислот — в наши дни задача для студента-старшекурсника. Тем не менее синтез пептидов до сих пор считается одним из труднейших видов химического синтеза. Действительно, чтобы получить нужную последовательность, концевые группы каждой аминокислоты нужно сначала модифицировать (химики говорят «защитить»). Аминокислот — двадцать типов; вариантов групп, подлежащих защите при синтезе — не менее десятка; каждую из них приходится активировать особым образом; освобождать синтезированный пептид от висящих на нем защитных группировок также нужно каждый раз по-разному. Учитывая все это, сравнение химика, ведущего пептидный синтез, с гроссмейстером, разыгрывающим ответственную партию и просматривающим варианты на десятки ходов вперед, вовсе не будет гиперболой.

Такое лестное сравнение правомерно для пептидных химиков даже сейчас, когда уже изучены многие удобные для пептидного синтеза реагенты, защитные группы, условия реакций с участием различных аминокислот и тому подобное. А что же говорить о тех гигантах, которые воздвигли и продолжают строить небоскреб химии пептидов: от немецкого химика Эмиля Фишера, первым предположившего и доказавшего, что белки и пептиды состоят из аминокислот (второй в истории химии нобелевский лауреат — 1902 год), к швейцарскому ученому Винсенту Дю Виньо, осуществившему первый синтез девятичленного пептида окситоцина (Нобелевская премия 1955 года), и американскому синтетику Брюсу Меррифилду, придумавшему революционное усовершенствование — так называемый твердофазный синтез пептидов и белков (Нобелевская премия 1984 года). Здесь названы только трое; но за сто с лишним лет существования химии белков и пептидов на ее небосклоне сияло и продолжает сиять несколько десятков ярких созвездий по-настоящему выдающихся ученых.

Рекорд в длине пептидной цепочки, синтезированной в лаборатории, был поставлен в 1969 году: две группы американских химиков независимо друг от друга объявили о получении полной аминокислотной последовательности белка рибонуклеазы А (сто двадцать четыре аминокислоты) и почти полной последовательности рибонуклеазы S — сто четыре звена. Синтетический препарат рибонуклеазы А обладал 70-80 процентами биологической активности природного белка, но было вполне вероятно, что этот уровень активности обусловлен не «правильной» последовательностью, а несколько искаженными побочными продуктами синтеза (например, цепочками с пропуском одной или нескольких аминокислот).

Поэтому усилия пептидных химиков сосредоточились на разработке таких методов синтеза и разделения его продуктов, которые обеспечивали бы безусловную химическую чистоту и полную биологическую активность синтезируемых пептидов. Поначалу считалось, что в этом отношении твердофазный синтез Меррифилда, основанный на применении особого аппарата — полуавтоматического синтезатора, — уступает традиционным подходам. Первый биологически активный пептид — хорошо известный биорегулятор ангиотензин — был получен с помощью нового метода в 1965 году Гарландом Маршаллом, учеником Меррифилда. И нелицеприятная дискуссия о чистоте продукта началась при первом же выступлении Гарланда в Европе.

Много позже, на рубеже столетий, когда я уже проработал немало лет бок о бок с профессором Гарландом Маршаллом, он признавался мне, что все еще не может забыть ледяной прием, оказанный его давнему докладу грандами пептидной химии. По счастью, среди них нашелся человек, который пригласил молодого аспиранта на чашку кофе и дал понять, что коллеги, в сущности, просто немного завидуют успеху — отсюда и такая реакция. Это был Йозеф Рудингер, легендарный пептидный химик из Праги — он, например, основал существующие до сих пор Европейские пептидные симпозиумы. Рудингер был вынужден бежать из Чехословакии дважды, в 1939 и 1968 годах: в Англию от оккупации гитлеровской и в Швейцарию от оккупации советской. Мне не довелось познакомиться с ним лично, но я не раз слышал рассказы о нем его ближайших сотрудников. Чаще всего вспоминали, как Рудингер, который совсем молодым пареньком служил в британских ВВС во время войны, любил обсуждать за кружкой пива воздушные бои над Ла-Маншем с Эрихом Вюншем, бывшим боевым летчиком люфтваффе, тоже ставшим после войны известным пептидным химиком.

После успеха с рибонуклеазой А сомневаться в принципиальных способностях синтеза пептидов воспроизводить длинные аминокислотные цепи уже не приходилось. Синтез превратился из научной задачи в задачу технологическую, хотя и весьма сложную: в случае с рибонуклеазой А понадобилось провести триста шестьдесят девять химических реакций и еще тысяча сто тридцать одну вспомогательную операцию. Эта ситуация подтолкнула развитие методов аналитической химии, в первую очередь различных видов хроматографии, позволяющих найти и выделить все возможные соединения, содержащиеся в реакционной смеси — буквально отыскать иголку в стоге сена. Кроме того, на помощь пришла новая идея — микробиологический синтез белков. Синтез последовательностей нуклеотидов гораздо проще химического синтеза белков, так что синтезировать последовательность нуклеотидов, кодирующую аминокислотную последовательность какого-нибудь белка, сравнительно легко. Полученную нуклеиновую кислоту внедряют затем в организм бактерии (обычно используют кишечную палочку вида Escherichia coli), которая и начинает синтезировать требуемый белок.

Тем самым пептидные химики, уже болезненно пережившие однажды вторжение в свои ряды роботов-синтезаторов, вынуждены были признать, что в гонке за длиной пептидной цепочки их опередили микроорганизмы. По счастью, научные задачи пептидной химии этим не исчерпываются: всегда интересно провести синтез пептида при каком-нибудь необычном сочетании аминокислот в цепи, придумать новую, более удобную, защитную группу, применить новый эффективный реагент — за сто лет многое еще осталось неисследованным. Но проблему получения практически любой пептидной или белковой молекулы в химически чистом виде сегодня можно считать решенной.

Трехмерная молекула

Яйцо издавна служило символом жизни; во многих религиях оно представляется вместилищем силы, которая способна породить все живое. С возникновением христианства яйцо получило дополнительное значение: снаружи яйцо выглядит мертвым, но внутри его находится новая жизнь, которая выйдет из него. Поэтому и появился обычай дарить друг другу пасхальные яйца, зачастую окрашенные красным — цветом пролитой крови Христа. Пасхальное яйцо напоминает о том, что Иисус восстанет из Своего гроба и даст новую жизнь.

Здесь, однако, налицо противоречие: ведь пасхальные яйца сварены вкрутую, что полностью исключает зарождение в них живого организма. Воскресения не произойдет — во всяком случае, из такого яйца. А почему, собственно? Ведь химический состав главных компонентов яйца — белков — при кипячении не изменится. Даже пептидные связи не разорвутся при температуре 100 °С.

Значит, правильно выстроенной в линию последовательности аминокислот еще недостаточно для проявления биологических свойств белков или пептидов. Молекула белка в клетке должна иметь какое-то дополнительное свойство, которое и позволило бы ей выполнять свою биологическую функцию. Это свойство заключается в способности принимать вполне определенную пространственную структуру, называемую также конформацией. Более того, именно конформация молекулы белка определяет его функцию в клетке.

Змейка Рубика: кошка, кобра, собака

Некоторое представление о том, что такое конформация, можно получить на примере распространенной детской игрушки — змейки Рубика. Она составлена из двадцати четырех одинаковых элементов — призм треугольного сечения, — причем соседние призмы соединены шарнирами, которые позволяют поворачивать разные части змейки друг относительно друга. При определенном навыке из линейной змейки, вытянутой в длину, можно построить более сотни различных двумерных и трехмерных фигурок: кота, кобру или, скажем, собаку.

Каждая из этих фигурок — специфическая пространственная структура змейки Рубика. И каждая имеет свой смысл, несет свою информацию: кошку не спутаешь с коброй или с собакой. В линейной цепочке эта информация содержится лишь в скрытом виде; чтобы она проявилась, одномерную змейку надо свернуть в трехмерную структуру, притом организованную вполне однозначным образом.

В белковых последовательностях не двадцать четыре, а сотни элементов-аминокислот, и не одинаковых, а разных — двадцать возможных типов. И различных фигурок-конформаций из них можно представить себе десятки тысяч. Но удивительным образом в живой клетке для всех молекул белка с одной и той же аминокислотной последовательностью реализуется только одна уникальная пространственная структура. Именно по этой конформации данный белок «узнают» другие молекулы в клетке, и с этого узнавания начинаются все биохимические реакции с его участием.

Конформация, о которой идет речь — ее называют нативной, то есть естественной, — существует в определенных условиях: в водном растворе заданной кислотности при температуре обычно не выше 42-45 °С и нормальном давлении. Если же условия изменяются — например, температура повышается до уровня кипения воды, — изменяется и эта конформация; точнее, она ломается. Белковая цепочка принимает другие пространственные структуры, но они уже не способны выполнять биологические функции белка, потому что остальные молекулы клетки их не узнают. Налаженная система взаимодействий внутри клетки прерывается, и жизнь прекращается: из крутого пасхального яйца цыпленок не вылупится.

Рассказ о том, что биологические функции белков и пептидов связаны с их пространственной структурой, можно было начать еще раньше, когда речь шла об основах химии пептидов. Для этого схематическую формулу аминокислоты пептидной цепочки следовало переписать вновь, но уже чуть-чуть по-другому:

чтобы стало понятней, что центральные атомы углерода (С) обладают, как говорят химики, четырьмя заместителями, причем все заместители у них разные. Каждый из них присоединен к атому С стерженьком, символизирующим валентную связь.

Но расположены заместители вокруг центрального углерода не так, как это изображено в «плоской» схематической формуле. На самом деле они размещены не в плоскости, а в пространстве, по вершинам тетраэдра — четырехгранника с треугольными гранями, — в центре которого находится атом углерода. Если теперь, с учетом сказанного, представить себе, что треугольник H₂N—С—СООН лежит в плоскости книжной страницы, то боковая цепь R и атом водорода Н неизбежно должны выходить из нее. При этом возможны два варианта, которые выглядят как показано на рисунке ниже.

Эти варианты строения аминокислоты не отличаются друг от друга ни молекулярной массой, ни химическими особенностями, ни затратами энергии, необходимыми для их синтеза, — решительно ничем, кроме оптических свойств. И тем не менее в живой природе синтезируется исключительно одна из этих пространственных форм, именно первая из изображенных, называемая «левой» аминокислотой. Ее энантиомер, «правая» аминокислота, хоть и встречается изредка в природных пептидах и белках, но только как результат действия ферментов, меняющих местами группы R и Н уже после включения аминокислоты в пептидную цепь.

«Левые» и «правые» аминокислоты

Явление подавляющего преобладания в живых организмах одного из двух возможных энантиомеров молекул (помимо аминокислот, таким же свойством обладают, например, сахара, только они не «левые», а «правые») впервые было обнаружено великим микробиологом Луи Пастером еще в 1848 году и известно как молекулярная асимметрия. Это открытие поставило целый ряд вопросов, затрагивающих основы естествознания. Дело прежде всего в том, что молекулярную асимметрию в организме невозможно объяснить, исходя только из представлений физики и химии: успешное функционирование в живых системах лишь «левых» аминокислот (или «правых» сахаров) обусловлено эволюционным отбором, сугубо биологическим фактором, аналога которому не найти ни в физике, ни в химии. То есть молекулярная асимметрия есть одно из характернейших свойств живого; можно даже сказать, что лишь система, способная различать зеркальные энантиомеры молекул (по рисунку легко убедиться, что «правая» аминокислота есть зеркальное отражение «левой»), достойна того, чтобы считаться по-настоящему живой.

С другой стороны, первоначальные элементы живого, в том числе и аминокислоты, могли образоваться сами собой в мелководных лагунах при разряде молний в первичной атмосфере Земли; эксперименты, моделирующие такие «доисторические» условия, вроде бы подтверждают это. Однако аминокислоты, получающиеся в подобных опытах, представляют собой так называемый рацемат, смесь равных количеств «левого» и «правого» энантиомера. Чтобы отобрать какой-либо один сорт из этой смеси, необходимо использовать молекулярную систему не менее сложную, чем простейший живой организм. Такая необходимость окончательно замыкает порочный круг типа «для зарождения живого требуется наличие живого», который может быть разорван теперь только за счет дополнительного предположения. Но какого: о чем-то или все же о Ком-то?

Вот в какие дебри, и вовсе не только биологические, а общефилософские, может завести упоминание об асимметрии биологических молекул. Но мы лишь еще раз подчеркнем, что молекулярная машина организма использует для своего нормального жизненного цикла энантиомеры строго определенного типа, то есть является, как принято говорить, стереоспецифичной. При этом стерео-специфичным в ней оказывается также и чрезвычайно эффективное воспроизводство энантиомеров. А между тем жесточайшим врагом пептидных химиков считается высокая степень самопроизвольного перехода тщательно отобранных «левых» энантиомеров аминокислот в их «правую» форму просто как следствие их включения в пептидную цепь.

Короче говоря, пространственное строение белковой молекулы играет важную роль для проявления ее биологических функций уже в силу наличия в ней асимметрических центров — атомов углерода, принадлежащих «левым», а не «правым» аминокислотам. Но это не единственный и даже не самый главный источник трехмерности структуры белков и пептидов. Основной вклад в создание пространственных форм их молекул вносит возможность внутримолекулярного вращения отдельных частей молекулы друг относительно друга, причем осями вращения могут служить так называемые одинарные валентные связи. Допустимы, например, внутренние вращения вокруг трех валентных связей, исходящих из центрального углеродного атома (N — С; С — С и С — R). Валентные структуры различных типов боковых цепей R тоже содержат одинарные связи, и, соответственно, подобные вращения происходят и в боковых цепях.

Понятно также, что эти рассуждения справедливы только по отношению к довольно примитивной модели молекулы, где атомы представлены шариками разного диаметра, а одинарные валентные связи — твердыми стерженьками. В действительности — то есть в модели следующего, квантового уровня — атомные ядра окружены электронными «облаками», которые, перекрываясь, создают связи между атомами в молекуле. Разрыв этих связей — необходимое условие химической реакции, создающей новую молекулу. Но если ограничиться изучением процессов узнавания молекулами в клетке друг друга, упрощенная модель белковой молекулы оказывается достаточной.

Такая модель действительно напоминает змейку Рубика, «молекулярный шарнир», способный изгибаться в пространстве, образуя разнообразнейшие трехмерные структуры. Длинная белковая цепочка, как уже говорилось, существует в клетке лишь в одной стабильной конформации, которая необходима для выполнения биологической функции белка. Однако для сравнительно коротких пептидов это не так: они могут принимать несколько устойчивых пространственных форм. Тем не менее пептидам удается играть роль природных биорегуляторов — а ведь молекулы в клетке узнают друг друга именно по вполне определенной пространственной структуре. Разрешение этого и многих других противоречий оказалось невозможным без использования теоретического конформационного анализа — подхода, в развитии которого приняла когда-то участие и наша группа молодых энтузиастов.

Глава 4

Как не получить Нобелевскую премию

Поставили на карту

К началу шестидесятых годов прошлого столетия ученые, изучающие молекулы, замороженные до кристаллического состояния, добились выдающегося успеха. Английские кристаллографы и биофизики Макс Перутц и Джон Кендрью установили пространственное строение миоглобина и гемоглобина — важнейших белков, обеспечивающих хранение и транспортировку кислорода в крови. Они использовали рентгеноструктурный анализ — процесс, включающий выращивание кристаллов белков, облучение их потоком рентгеновских лучей и тщательное изучение картины отражения этих лучей от атомов белковых молекул. Оба белка представляли собой совокупности так называемых альфа-спиралей, регулярных структур, в которых каждый четвертый аминокислотный остаток сближен друг с другом. Положение атомов в пространстве было определено с точностью до ангстремов — стомиллионных долей сантиметра. Нобелевскую премию за эту работу Кендрью и Перутц получили в 1962 году.

С тех пор рентгеноструктурная кристаллография добилась колоссальных успехов: трехмерные структуры тысяч белковых молекул уже расшифрованы с помощью этого подхода. Однако против него всегда выдвигалось принципиальное возражение о том, что белок, замороженный в кристалле, может иметь иную пространственную структуру по сравнению с тем же белком в растворе — то есть в организме. Метод же, позволяющий построить конформацию белка вне кристалла по изменениям определенных параметров его атомов под воздействием сильного магнитного поля — ядерный магнитный резонанс (ЯМР), — в те времена был применим лишь к небольшим молекулам. Но после кардинального усовершенствования метода, отмеченного Нобелевской премией 2002 года (Курт Вютрих), трехмерные структуры белков в растворе стало возможным восстанавливать с высокой точностью — и они оказались схожими со структурами тех же белков, полученными рентгеноструктурной кристаллографией. А совсем недавно появился новый подход к проблеме, так называемая криоэлектронная микроскопия: растворы белков замораживают и рассматривают под электронным микроскопом. При этом весьма трудоемкий этап выращивания подходящих для рентгеноструктурного анализа кристаллов исключается, но точность определения положений атомов белков снижается; в самых последних работах, однако, она уже достаточно высока для построения надежных моделей белковых молекул.

Пространственная структура миоглобина, определенная рентгеноструктурным анализом (индекс 1MBN). Слева: схематическое изображение, показывающее ориентацию спиралей; справа: изображение, где однотипные атомы представлены как шарики одного и того же диаметра и того же оттенка

Казалось бы, рентгеноструктурный анализ может без особого труда восстанавливать пространственные структуры молекул пептидов, длина цепочек которых в десятки, а то и в сотни раз меньше, чем у белков. Но нет — выяснилось, что гораздо легче определить пространственное строение длиннейшей белковой молекулы, чем коротенького пептида.

Для понимания этого парадокса вновь обратимся к модели молекулы, состоящей из твердых шариков-атомов, насаженных на жесткие стержни — валентные связи. Атомы внутри молекулы способны взаимодействовать друг с другом — притягиваться и отталкиваться; в первом приближении можно считать, что все пары атомов, которые не связаны жесткими валентными связями, соединены слабыми пружинками. Эти взаимодействия заставляют отдельные части молекулы вращаться вокруг одинарных связей в поисках такого положения, когда межатомные внутримолекулярные пружинки в сумме уравновесят одна другую и конформация молекулы станет устойчивой. Подобные вращения зависят еще и от взаимодействия с соседними молекулами, например с молекулами растворителя.

С увеличением длины цепочки растет и число одинарных связей, то есть возможностей внутримолекулярного вращения; в принципе, чем больше молекула, тем большее количество конформаций для нее может быть доступно. Мерой устойчивости конформаций служит суммарная внутримолекулярная энергия (скажем, степень натяжения межатомных пружинок). Чем ниже уровень такой энергии для молекулы в данной конформации, тем больше вероятность того, что молекула будет существовать в этой конформации. Так вот, молекулы очень многих белков, обладая огромным количеством возможных внутримолекулярных вращений, тем не менее устроены так, что какой-то одной из конформаций — нативной — соответствует энергия гораздо более низкая, чем энергии всех других потенциально устойчивых пространственных структур той же молекулы.

Эта конформация, кроме того, удовлетворяет принципу плотной упаковки, согласно которому в реальных глобулах (еще одно название пространственных структур белков) как можно больше атомов стремятся расположиться поближе друг к другу, а точнее — на взаимных расстояниях, соответствующих максимальным степеням сжатия наших гипотетических межатомных пружинок. В понижение общей внутримолекулярной энергии вносит свой вклад, пусть и очень небольшой, каждая пара взаимодействующих атомов. А поскольку число пар взаимодействий в белке велико, суммарный эффект будет значительным: конформация, более других соответствующая принципу плотной упаковки, окажется в самом выгодном положении. Если же подобных пар мало — как в относительно небольшом пептиде, — то общее понижение энергии не сможет выделить «плотноупакованную» конформацию из прочих, и, следовательно, молекула пептида имеет больше шансов существовать в виде нескольких практически равноправных конформаций. Именно это ограничивает возможности рентгеноструктурного анализа пептидов: понятно, что гибкую молекулу пептида гораздо труднее «заморозить» в кристаллическом виде. И действительно, данных о конформациях пептидов в кристалле сравнительно немного.

С другой стороны, молекула пептида в растворе может постоянно — и быстро — переходить из одной равноправной конформации в другую, а множество пептидных молекул в растворе могут одновременно принимать разные конформации. Поэтому любой экспериментальный метод, измеряющий, например, расстояние между какими-то атомами молекулы в растворе, на выходе даст лишь усредненную величину, которая, вообще говоря, может не относиться ни к одной из этих конформаций в отдельности. (Сходный эффект использует оптический обман, именуемый кинематографом: кадры сменяются так быстро, что мы видим на экране плавный полет птицы, хотя на пленке запечатлены лишь прерывистые отдельные моменты этого полета.)

Этого недостатка экспериментальных методов лишены методы теоретические, расчетные — надо лишь научиться вычислять значения внутримолекулярной энергии, соответствующие каждой из возможных конформаций молекулы. Конформации, обладающие наиболее низкими энергиями, могут считаться наиболее устойчивыми, а конформации с высокими значениями энергии имеют малую вероятность осуществиться, и их можно исключить из рассмотрения. В результате получится не одна «усредненная» пространственная структура, а целый набор стабильных низкоэнергетических конформаций пептидной молекулы. Каждая из них может, в принципе, реализоваться в растворе и внести свой вклад в измеряемую «усредненную» структуру.

Процедура такого расчета и есть теоретический конформационный анализ — наконец-то этот термин получает объяснение, — или, как его иначе называют, конформационные расчеты. Для его проведения не нужны громоздкие и весьма дорогостоящие экспериментальные установки, которые даже в наши дни производятся не массовыми сериями, а по штучным заказам. Нужен лишь компьютер, устройство, достаточно широко распространенное уже полвека назад. Правда, по мощности и быстродействию тогдашние компьютеры были сравнимы разве что с чипами, встроенными в сегодняшние наручные часы.

С таким-то оборудованием некоторые отчаянные головы в разных странах взялись почти одновременно и независимо друг от друга за расчеты внутримолекулярных энергий конформаций аминокислот, пептидов и белков. Предстояло не только разработать удовлетворительные методы вычисления энергии в отдельной конформации, но и справиться с огромным — в перспективе — объемом таких вычислений. Для десятичленного пептида, например, число в принципе возможных конформаций оценивается как 1010 (прописью: десять миллиардов). Теоретический конформационный анализ обязан либо уметь рассчитать энергию каждой из них, либо объяснить, почему данная конформация исключена из рассмотрения.

Минимальный участок змейки Рубика, позволяющий сделать линейную цепочку трехмерной, — это две жесткие призмы, соединенные шарниром. Точно так же минимальный фрагмент пептидного остова, способный к конформационным изменениям, — аминокислотный остаток, две пептидные группы, соединенные центральным атомом углерода (его еще называют Сα; символ Сβ обозначает первый из атомов боковой цепи).

Схематическое изображение типичного аминокислотного остатка

В этом фрагменте может быть лишь два угла вращения: вокруг связей N — С (φ) и Сα — С (ψ); связь С — N не одинарная, а так называемая полуторная, и угол вращения вокруг нее почти всегда равен 180°, что обеспечивает максимальное удаление двух атомов Сα, входящих в состав пептидной группы. Повороты соседних элементов змейки Рубика друг относительно друга ограничены возможностями шарниров между ними; взаимные вращения соседних пептидных групп тоже ограничены. Рассчитав сумму энергий взаимодействий между всеми атомами аминокислотного остатка, можно построить его конформационную карту — таблицу значений внутримолекулярной энергии для каждой пары значений углов поворота φ и ψ.

Первая такая карта была рассчитана в 1963 году в Индии группой под руководством Г. Н. Рамачандрана для как можно более простой модели молекулы. Предполагалось, что атомы-шарики абсолютно твердые, а длины валентных связей и величины валентных углов фиксированны; вычисления проводились на обыкновенном настольном калькуляторе. На «карте Рамачандрана» фигурировали лишь два типа конформаций аминокислотного остатка (они же пары величин φ и ψ): «запрещенные» (сферы хоть одной пары шариков пересекаются) и «разрешенные» (ни одного пересечения нет).

Несмотря на все упрощения, карта хорошо объясняла известные к тому времени данные рентгеноструктурного анализа. Именно точки, соответствующие парам углов φ и ψ, полученным по атомным координатам белков и пептидов, найденным в эксперименте, ложились в «разрешенные», а не «запрещенные» области карты Рамачандрана. Правда, по мере появления новых экспериментальных пространственных структур белков стало ясно, что некоторые точки попадают и в «запрещенные» области. Но прецедент был создан: было показано, что даже грубые и заведомо неточные расчеты в какой-то степени отражают реальные конформационные возможности белков.

Уточнения модели начались с того, что взаимодействие между парами атомов («пружинка») было представлено в виде функции, зависящей от межатомного расстояния («потенциальная функция»). Эта функция должна была иметь максимум при минимальном расстоянии — когда твердые шарики перекрылись бы, — переходить к нулевому значению на больших расстояниях и иметь слабый минимум где-то в промежутке. Параметры функции зависят от типа пары взаимодействующих атомов и могут быть определены либо эмпирически, по физическим свойствам газов и кристаллов, либо получены из подробных квантовомеханических расчетов.

Эмпирическая потенциальная функция энергии взаимодействия пары атомов, где r — расстояние между атомами, δ — расстояние, меньше которого начинается отталкивание атомов (шарики перекрываются), и ε — минимальное значение энергии

Последний способ, вообще говоря, более оправдан с точки зрения физики, поскольку использует более глубокие уровни строения атомов и молекул. Но неожиданным образом конформационные карты, построенные с использованием квантовых расчетов (по необходимости упрощенных), содержали низкоэнергетические («разрешенные») области, в которые значения углов φ и ψ, найденные в эксперименте, попадали крайне редко. Карты же, вычисленные с помощью эмпирических потенциальных функций, согласовались с экспериментом гораздо лучше.

Это обстоятельство постоянно беспокоило квантовых химиков, работающих с пептидными молекулами, и вызывало их споры с «эмпириками». В середине девяностых я был на небольшом симпозиуме в Иерусалиме, где познакомился с профессором Шнеиром Лифсоном и его учеником Майклом Левиттом (будущим Нобелевским лауреатом). Лифсон был химиком с широким спектром научных интересов, в число которых входило и исследование межатомных взаимодействий в биологических молекулах. В этом направлении работал еще один ученик Лифсона, Арни Хаглер, предложивший, в частности, новый квантовохимический набор межатомных потенциальных функций, не улучшивший, однако, соответствие расчетной конформационной карты и данных рентгеноструктурного анализа. Но это обстоятельство его не смутило: он полагал, что новые экспериментальные результаты — когда-нибудь в будущем — подтвердят расчеты, основанные, в конце концов, на совершенно правильных теоретических соображениях. На этом месте я не удержался и ляпнул сдуру, что как человек, выросший при советской власти, я постоянно слышал рассуждения о теоретической безупречности коммунистического учения, которое должно было привести к светлому будущему — но только вот будущее это все никак не наступало... Аудитория похихикала, но с Арни я с тех пор не виделся и не разговаривал — а ведь когда-то он довольно дружелюбно воспринял идею (так и не осуществившуюся) о моей работе в основанной им компании.

Конформационные карты аминокислотных остатков были получены несколькими группами в разных странах на основе различных типов эмпирических потенциальных функций. Наша группа использовала слегка модифицированные потенциалы, предложенные Валерием Григорьевичем Дашевским, соратником известного кристаллографа Александра Исааковича Китайгородского. И хоть нам приходилось придумывать всякие программистские трюки для ускорения процесса счета на электронно-вычислительной машине «Минск-22» и дежурить при ней по ночам — техника безопасности: а вдруг загорится? — процесс пошел. Первым результатом была карта, на которой все значения внутримолекулярной энергии оказались равны нулю. Но нас обрадовало и это, потому что количество нулей было правильное — сто сорок четыре, двенадцать на двенадцать, перебор всех пар значений углов с интервалом в тридцать градусов. «День первых нулей» мы отмечали впоследствии как свой профессиональный праздник по образцу Дня танкиста или Дня работника пищевой промышленности. А когда ошибку исправили, рассчитанные нами карты в основном совпали с картами других исследователей из США, Италии, Бельгии, Индии и Советского Союза. Мы стали членами клуба.

Салат «Брадикинин»

Конформационные карты аминокислотных остатков были хорошим началом — они не противоречили уже имеющимся экспериментальным данным. Но ценность любой теории не столько в умении объяснить уже известное, сколько в возможности успешно предсказать результат эксперимента. В этом, собственно говоря, и заключается основная цель драг-дизайна — предсказать биологические функции молекулы еще до проверки их на практике.

Функции молекул в клетке, особенно пептидных и белковых, зависят от их пространственных структур. Если теоретический конформационный анализ научится надежно предсказывать такие структуры, значительный (и необходимый!) шаг на пути к направленному драг-дизайну пептидных биорегуляторов будет сделан. Членам интернационального клуба конформационных карт это было очевидно с самого начала — но их останавливала тогдашняя неполнота физических моделей молекул, начиная с неточности потенциальных функций межатомных взаимодействий и еще более приблизительного учета взаимодействий с растворителем. Отважиться на проведение конформационного расчета полной молекулы реального пептида с тем, чтобы найти все его стабильные конформации, могли лишь авантюристы. И такие появились — в нашем лице.

Объектом исследования был выбран брадикинин, линейный пептид с последовательностью из девяти аминокислот. Брадикинин расслабляет сосуды и тем самым снижает давление крови; он же участвует в биохимических реакциях при воспалениях и проявлениях боли. Нас, однако, привлекли не его биологические свойства, а сравнительно ограниченные конформационные возможности его пептидного остова.

Рассчитанные заранее конформационные карты показали, что полный конформационный расчет брадикинина должен проанализировать как минимум пятьсот семьдесят шесть пространственных структур пептидного остова; для девятичленного пептида иной последовательности их могло бы быть порядка двадцати тысяч. Пять-шесть сотен — это тоже очень много: ведь каждую из таких конформаций следовало выбрать как начальную точку расчета межатомной энергии. Между тем при наших вычислительных ресурсах этот процесс занимал несколько часов лишь для одной конформации брадикинина. Позволить себе десятки, а то и сотни суток непрерывного счета мы не могли.

Вместо этого пришлось придумать новое упрощение — предположение, что взаимодействия аминокислот, отдаленных в пептидной последовательности друг от друга, менее влияют на конформационную стабильность молекулы в целом, чем взаимодействия отдельных фрагментов, входящих в эту последовательность. Иными словами, в первом приближении можно попытаться составить возможные конформации молекулы брадикинина, комбинируя наборы стабильных конформаций его фрагментов, — а рассчитать энергии этих наборов гораздо легче. Таким способом можно также удлинять цепочку: начать, например, с тетрапептида 1-4, затем скомбинировать его низкоэнергетические конформации со стабильными структурами тетрапептида 2-5 и провести расчет конформационных энергий пентапептида 1-5, потом добавить конформации фрагмента 3-6 и так далее. Для молекул белков, где пространственная структура зачастую определяется взаимодействиями остатков, далеко отстоящих друг от друга в аминокислотной последовательности, этот подход не годится; но для сравнительно небольших пептидов он может быть правомерен.

Полный конформационный расчет брадикинина показал возможность существования всего нескольких низкоэнергетических конформаций молекулы. Все они характеризовались резким изломом в центре пептидного остова; у некоторых к тому же боковая цепь первого в цепи аминокислотного остатка (заряженная положительно) и группа, замыкающая остов молекулы (заряженная отрицательно), близко подходили друг к другу. Оказалось, таким образом, что линейный пептид брадикинин может образовывать квазициклические конформации. Расчетная стабильность этих структур сохранялась и при нейтрализации заряженных групп, а также при введении в рассмотрение растворителя. Это была маленькая сенсация: мало того что никто в мире до тех пор не осуществил конформационный анализ пептида такой величины, было предсказано еще и новое свойство линейных пептидов — способность к самопроизвольной квазициклизации.

Главная же сенсация, однако, заключалась не в наших предсказаниях — мало ли что болтают теоретики, — а в том, что они были подтверждены независимым экспериментом. Одновременно с нашей работой московские ученые (Вадим Тихонович Иванов с сотрудниками) провели целый ряд экспериментальных измерений конформационных характеристик молекулы брадикинина. Их общий вывод был следующим: в конформационном равновесии брадикинина в растворе действительно присутствуют структуры изогнутой или псевдоциклической формы со сближенными концами пептидной цепи.

Тем самым квазициклическая модель пространственной структуры брадикинина получила право на существование, и о ней было доложено на весьма авторитетном форуме — четвертом Американском пептидном симпозиуме в Нью-Йорке. В выступлении Иванова, кроме экспериментальных, были использованы и наши расчетные данные. Текст доклада в «Трудах симпозиума» был завершен фразой: «Более того, открыт новый принцип пространственной организации линейных пептидов, согласно которому молекулы образуют циклы благодаря ионному взаимодействию ионогенных групп, расположенных на противоположных концах молекулы».

Вообще-то дело было не только в том, что положительный и отрицательный электрические заряды притягиваются друг к другу: такое притяжение лишь закрепляет и без того сближенные части молекулы. Но как раз гипотетическое наличие «ионной связи» между концами молекулы и подверглось наиболее ожесточенным нападкам противников новой идеи квазициклизации, многие из которых попросту не могли себе представить, как это линейная пептидная цепочка вдруг примет циклическую форму.

Сразу нашлось и резонное возражение: в водном растворе, этой естественной «среде обитания» пептидных биорегуляторов, заряженные группы окружены плотной оболочкой из молекул воды, и поэтому их взаимодействие резко ослаблено; следовательно, молекулярные квазициклы в воде должны разваливаться. Появились и новые экспериментальные работы по конформациям брадикинина, вроде бы противоречащие данным доклада в Нью-Йорке, — как всегда, новая идея вызвала весьма разноречивые отклики.

Нужен был решающий эксперимент, призванный либо окончательно подтвердить, либо окончательно опровергнуть модель квазициклического строения брадикинина. И здесь центр тяжести событий переместился в Ригу, в лабораторию пептидного химика Гунара Чипенса. Предложение рижан было простым и, пожалуй, даже очевидным: заменить «ионную связь» на обыкновенную валентную и проверить, будет ли получившаяся молекула — циклический аналог — обладать биологической активностью брадикинина. Соответствующий циклоаналог был синтезирован, и его биологические испытания показали, что при введении в кровь крыс он действовал, как и природный брадикинин, — снижал давление крови, но не на протяжении нескольких секунд, а в течение более чем трех часов. Зато он не продемонстрировал никакого влияния на изолированный орган (кишка крысы), обычно реагирующий на брадикинин. (О современных испытаниях на культурах клеток или на изолированных рецепторах в те времена можно было только мечтать.)

Расчетная конформация брадикинина (сверху) и схематическое изображение циклобрадикинина (снизу). В рисунке использованы условные трехбуквенные обозначения аминокислот

Таким образом, удалось не просто подтвердить квазициклическую модель строения брадикинина, но и синтезировать аналог, обладающий длительным и к тому же высокоизбирательным биологическим эффектом. Этот аналог стал первым в ряду совершенно нового класса соединений, которые в дальнейшем оказались весьма перспективными с практической точки зрения, — циклических аналогов линейных пептидов. Следовательно, со всеми возможными оговорками, можно было констатировать, что теоретический конформационный анализ пептидов действительно пригоден как инструмент драг-дизайна — пусть даже это утверждение пока базировалось лишь на расчетах одного-единственного брадикинина.

Успех полагалось отпраздновать, помимо традиционных возлияний, чем-то выдающимся — и наш руководитель Станислав Геннадьевич Галактионов изобрел салат «Брадикинин». Продукт этот был назван в честь пептида и так же, как и он, состоял из девяти компонентов: пассерованного лука (две луковицы средних размеров), сливочного масла, на котором пассеруется лук, вареной моркови (три-четыре штуки), крутых яиц (две штуки), рыбы в собственном соку из консервной банки (три-четыре ломтика), маринованных оливок (полчашки), майонеза, разваренного риса (чашка) и лимонного сока. Компоненты готовятся заранее, измельчаются, рис и рыба растираются до состояния однородной массы, в которую добавляется все остальное. Затем салат перемешивается, поливается лимонным соком и заправляется майонезом. В результате получается продукт очень нежного и своеобразного вкуса, который в любых застольях всегда принимается восторженно. Попробуйте приготовить его сами: салат хоть и трудоемкий, но особой квалификации не требует.

Кулинария была лишь одним из многих талантов Станислава Геннадьевича. В свое время он окончил Белорусский лесотехнический институт и защитил диссертацию о влиянии ионов хлора на урожайность картофеля. Но молодой кандидат биологических наук уже тогда понимал, что биология стала молекулярной. Поэтому он обратился к физике и добавил к своим фундаментальным общебиологическим представлениям взгляд на биологические процессы с точки зрения физики. В частности, он придумал оригинальный математический алгоритм построения координат любого атома по координатам атомов, предшествующих ему в молекулярной цепочке. Этот метод позволял ускорить процедуру вычисления и давал надежду на определение трехмерной пространственной структуры молекул. Надежда оправдалась, и расчет брадикинина утвердил провинциала-самоучку, не принадлежавшего ни к одной из столичных научных школ, в качестве ведущего представителя нового научного направления — молекулярного моделирования пептидов и белков.

Но только в стране победившего социализма. К сожалению, в те годы опубликовать наши работы за рубежом было практически невозможно. Нет, мы могли подготовить статью к печати и даже, по хорошему знакомству, получить ее официальное направление в иностранный журнал в своем родном учреждении. Но дальше следовало получить разрешение так называемого первого (секретного) отдела. А там происходил следующий диалог (вспоминаю по реальному случаю, произошедшему со мной самим по молодости и наивности):

— Почему вы хотите отправить статью в зарубежное издание? Ведь у нас есть свои замечательные журналы, например «Весцi Акадэмii навук БССР».

— Нотам статьи публикуются по-белорусски...

— Ну и что же? Если ваша статья так важна для зарубежных коллег, пусть они выучат наш язык...

Зато признанный классик молекулярного моделирования пептидов и белков Гарольд Шерага, член Национальной академии наук США, человек, по работам которого мы учились, оценил наши результаты весьма высоко. Во время горбачевской перестройки я встретился с ним в Польше — выехать в социалистические страны было уже можно — и рассказал, как мог, о наших успехах. Профессор Шерага был просто поражен — он никак не ожидал, что в далекой России, притом не в Москве, его научное направление шагнуло так далеко. И когда я окончательно перебрался в США, его рекомендация во многом обеспечила мне хороший прием коллег и, главное, устройство на работу.

Сильней трясти надо

Вариант молекулярного моделирования, разработанный нашей группой, относился к так называемой молекулярной механике. Пептидная молекула, состоящая из шариков-атомов, соединенных стерженьками — валентными связями, и в самом деле не слишком отличалась от чисто механической системы — той же змейки Рубика. Это сходство подчеркивалось еще и тем, что набор в принципе возможных трехмерных структур молекулы задавался извне комбинациями заранее вычисленных низкоэнергетических конформаций аминокислотных остатков. Точно гак же любые допустимые пространственные структуры змейки могли быть образованы лишь фиксированными поворотами шарниров, соединяющих ее фрагменты.

Перебрать таким способом конформации небольшой пептидной молекулы — и не пропустить самые низкоэнергетические из них — можно, но для длинных белковых цепочек этот подход не подойдет из-за астрономического количества возможностей, которые надо будет учитывать. С другой стороны, в случае белка заранее известно, что нас интересует только одна конформация — нативная, та, в которой белок с данной аминокислотной последовательностью существует в растворе. Только она обеспечивает биологическую функцию белка, и задача теоретического конформационного анализа белков состоит в том, чтобы отыскать именно эту конформацию.

Известно, кроме того, что многие белки обладают способностью к так называемой ренатурации, самопроизвольному восстановлению пространственной структуры. Белковая молекула может свернуться в нативную конформацию сама по себе, под влиянием главным образом своих собственных внутримолекулярных взаимодействий. А раз так, к чему сложные алгоритмы перебора конформационных возможностей белков: достаточно задать хоть какие-то начальные координаты атомов молекулы — и их взаимодействия должны привести к нативной пространственной структуре. Подход, основанный на таких соображениях, получил название молекулярной динамики.

Математическое воплощение процесса молекулярной динамики сводится к решению системы уравнений Ньютона (того самого, из средней школы), описывающей движения каждого атома во времени под воздействием сил притяжения и отталкивания его соседей. Движения всей молекулы можно представить себе как некую траекторию, проходящую по энергетическому ландшафту — по «долинам» и «оврагам» с относительно низкой энергией и «перевалами» между ними. В таком представлении нативная конформация белковой молекулы будет находиться на дне самой глубокой впадины этого ландшафта. Чтобы достичь ее, надо научиться преодолевать «перевалы», встречающиеся по пути, и не застревать в промежуточных «долинах» и «оврагах». Для этого в уравнениях движения учитывается не только потенциальная энергия взаимодействия атомов, но и кинетическая составляющая, зависящая от условной температуры молекулярной системы. При увеличении температуры вероятность изменить состояние системы атомов — перескочить через «перевал» — значительно возрастает.

Многие алгоритмы, «подталкивающие» систему к состоянию с наименьшей энергией, были предложены вовсе не для биологических молекул. При создании атомной бомбы, например, для расчетов рассеяния нейтронов использовался метод Монте-Карло. Его идея заключалась в том, что случайное изменение состояния системы нейтронов принимается или отвергается в качестве последующего шага на траектории энергии в зависимости от вероятности понижения энергии системы. И не только нейтронов — системы любых объектов, энергия которой может быть вычислена. И даже не только энергия, но и другие величины — метод Монте-Карло применяется сейчас в самых различных областях, от чистой математики до исследований глобального потепления.