Коннектом. Как мозг делает нас тем, что мы есть

Развитие науки может надолго затормозиться, если нет соответствующей технологии. Без нужной информации научный прогресс невозможен, и неважно, сколько умников работает над решением проблемы. В XIX веке долго тщились по-настоящему разглядеть нейроны, и наконец Гольджи разработал свой метод, который вскоре начал весьма охотно использовать не кто иной, как Кахаль. В 1906 году Гольджи с Кахалем съездили в Стокгольм за Нобелевской премией «за работу по выявлению строения нервной системы». Следуя традиции, оба прочли короткие лекции, где описывались их исследования. Но в ходе этих лекций они предпочли не радоваться общей награде, а обрушиться с нападками друг на друга.

До этого между ними долго кипела жаркая дискуссия. Окрашивание по методу Гольджи наконец-то явило миру нейроны, однако сравнительно небольшая разрешающая способность тогдашних микроскопов все-таки оставляла место для сомнений и неоднозначных трактовок. Заглянув в свой микроскоп, Кахаль увидел точки, в которых два нейрона контактировали друг с другом, оставаясь разделенными. А когда Гольджи посмотрел в свой микроскоп, ему показалось, что в таких точках нейроны сливаются воедино, образуя сплошную сеть, что-то вроде гигантской клетки.

К 1906 году Кахаль убедил многих коллег, что между такими нейронами все-таки есть просветы, однако по-прежнему оставалось неясным, как же нейроны умудряются передавать друг другу сигналы, если они не соединены физически. Три десятилетия спустя Отто Лёви и Генри Дейл получили Нобелевскую премию «за открытия, связанные с химической передачей нервных импульсов». Они обнаружили убедительные доказательства того, что нейроны могут отправлять друг другу сигналы путем выработки молекул нейротрансмиттеров и получать сигналы, детектируя нейротрансмиттеры. Эта идея химического синапса объясняла, каким образом двум нейронам удается общаться через узкий просвет.

Но сам-то синапс тогда еще никто не видел! В 1933 году немецкий физик Эрнст Руска сконструировал первый в истории электронный микроскоп. В этом приборе вместо луча света использовался поток электронов, что позволяло получать гораздо более четкое и резкое изображение. Руска перешел на работу в компанию Siemens и запустил свое изобретение в массовое производство. После Второй мировой войны популярность его детища только возросла. Биологи научились рассекать образцы на чрезвычайно тонкие слои, а затем помещали их под электронный микроскоп. Наконец-то они увидели четкое и ясное изображение.

Первые изображения синапсов, полученные в 1950-х годах, показали, что два нейрона все-таки не «сливаются» в синапсе: две нервные клетки разделены четкой границей, иногда можно различить даже узенький просвет между ними. Оптический (световой) микроскоп не позволял разглядеть такие детали, вот почему Гольджи с Кахалем так и не смогли разрешить свой спор при жизни.

С учетом этих новых сведений можно посмертно присудить победу Кахалю. Впрочем, не совсем так. Ведь Гольджи в конечном счете тоже оказался прав. Как я уже говорил, помимо химических синапсов, мозг содержит и электрические. В синапсе этого типа щель между двумя мембранами соседних нейронов пронизана особыми ионными каналами, по которым ионы (заряженные частицы) могут перемещаться из внутренней части одного нейрона во внутреннюю часть другого. Такой синапс передает электрические сигналы между нейронами напрямую, ему не нужен химический сигнал-посредник. По сути, он объединяет две клетки в одну большую, как и представлял Гольджи.

Рис. 28. Поперечное сечение аксонов и дендритов под электронным микроскопом до (слева) и после (справа) оптического размывания

Я расхваливал электронный микроскоп как изобретение, позволившее получить изображение синапсов. Однако новые методы окрашивания тоже оказались важны. С появлением электронной микроскопии понадобились методы массированного окрашивания, при которых помечаются все нейроны. Комбинация электронного микроскопа и таких методов массированного окрашивания дала нейробиологам возможность воочию увидеть то, что они давно себе представляли, но до сих пор не могли пронаблюдать: переплетение ветвей множества нейронов. Окрашивание по Гольджи демонстрирует форму нейрона, однако создает ложное впечатление, будто нейроны – острова, плавающие в пустоте. На самом же деле ткань мозга буквально набита нейронами и их отростками (рис. 28, слева). Эта картинка подобна той, которую можно увидеть, разрезав комок спутанных макарон. Их отдельные волокна окажутся круглыми или овальными в разрезе – подобно нейронным отросткам на снимке.

Законы физики ограничивают разрешающую способность оптического микроскопа длиной волны света, которая составляет доли микрона. Более мелкие детали будут выглядеть размыто: это проявление так называемого дифракционного барьера. На рис. 28, справа, показан искусственно размытый вариант изображения, полученного с помощью электронного микроскопа. Так объект выглядел бы в оптическом микроскопе. Поперечные сечения самых тонких отростков нейронов не удавалось бы четко разглядеть. Вот почему метод фрагментарного окрашивания, метод Гольджи, когда помечается лишь небольшая доля нейронов, оказался необходим при использовании оптического микроскопа. Электронный микроскоп обладает гораздо более высокой разрешающей способностью, что позволяет одновременно видеть все нейроны образца, пометив их методом массированного окрашивания.

Но электронный микроскоп дает нам лишь двухмерное изображение поперечных сечений нейронов. Чтобы увидеть их во всей красе, нужна трехмерная картинка. Ее можно получить, разрезав мозговую ткань на тонкие ломти, как колбасу, и снять изображение каждого ломтика. Может показаться, что такое разрезание – элементарная задача, однако каждый слой должен быть в десятки тысяч раз тоньше кусочка самой изысканной ветчинной нарезки. Для этого потребуется весьма необычный нож.

* * *

Я всегда питал слабость к ножам. Еще в первые скаутские годы я заполучил свой первый карманный ножик, дешевенький, с двумя лезвиями, которые быстро потускнели. Мальчишка постарше как-то раз показал мне свой швейцарский армейский нож с ярко-красной ручкой, ощетинившийся множеством разнообразных сверкающих лезвий и прочих инструментов. Конечно, меня одолела зависть. Ныне я предпочитаю немецкие поварские ножи из углеродистой нержавеющей стали. (Я не настолько фанат ножей, чтобы выбирать более острые, однако способные ржаветь.) Обожаю шуршание и скрежет ножа, который востришь на точильном круге, и восхитительное ощущение, когда он скользит сквозь мякоть помидора.

А вот пристрастия людей к алмазам я никогда не понимал. Ну да, они красиво сверкают, но кубик циркония или даже просто ограненного стекла сияет не хуже. Куда прелестнее бледная голубизна аквамарина или кровавый багрянец рубина! Эти великолепные цвета гораздо сочнее блеклой и пустой прозрачности бриллианта.

Но потом на моем пути встретился алмазный нож.

Рис. 29. Ножи: алмазный (слева) и металлический (справа)

Чтобы оценить необычность этого инструмента, давайте начнем с загадки: чем нож отличается от пилы? Вы можете ответить, что у пилы режущий край зазубренный, а у ножа – гладкий. Или что нож кончается острием, а торец полотна пилы – тупой. Но под микроскопом все эти различия исчезают. Какой бы гладкой режущая кромка любого металлического ножа ни казалась невооруженному глазу, при увеличении она выглядит зазубренной и тупой. Даже остро наточенный нож японского шеф-повара, разделывающего суши, выглядит тупым и грубым, словно дубинка.

Однако существует нож, чье редкостное совершенство выдерживает и пристальный осмотр. Режущая кромка хорошо наточенного алмазного ножа выглядит замечательно острой и гладкой даже под электронным микроскопом. Ее ширина – всего 2 нанометра, т. е. примерно 12 атомов углерода. На атомном уровне, может быть, и видны кое-какие щербинки, но у лезвия высокого качества они встречаются нечасто. Преимущества такого резака перед металлическим ножом очевидны, достаточно взглянуть на их изображения, полученные с помощью электронного микроскопа (рис. 29).

Алмазный нож – самый совершенный среди множества типов резаков, применявшихся в истории микроскопии, а история эта насчитывает не одно столетие. Клеточные структуры растительных и животных тканей лучше всего видны, если разрезать образец на тонкие слои. Для световой микроскопии такие ломтики должны быть толщиной с человеческий волос. Поначалу образцы готовили вручную, при помощи бритвенных лезвий. В XIX веке для этого изобрели специальные машины – микротомы. Кусочек биологической ткани постепенно, небольшими одинаковыми «шажками», двигался к ножу (или, наоборот, к нему двигался нож), что позволяло получать ломтики равной толщины.

Микротом дает толщину до нескольких микронов. Для световой микроскопии этого более чем достаточно, однако с появлением электронного микроскопа стало необходимо резать еще тоньше. В 1953 году Кейт Портер и Джозеф Блюм сконструировали первые ультрамикротомы. Эти машины умели нарезать образцы на удивительно тонкие ломтики – до пятидесяти нанометров, более чем в тысячу раз меньше толщины человеческого волоса. Вначале ультрамикротомы оснащались стеклянными ножами, но алмазные оказались лучше. Их совершенная острота дает чистые разрезы, к тому же они достаточно долговечны и могут отрезать множество ломтиков, прежде чем затупятся. Как вы понимаете, мозговую ткань следует тщательно и осторожно подготовить к разрезанию в ультрамикротоме. По консистенции она мягкая, словно тофу, и может распасться, если ее резать в свежем состоянии, так что предварительно ее заливают эпоксидной смолой, позже затвердевающей в сплошной монолит, похожий на кусок пластика.

Поначалу микротомы применялись для получения отдельных двухмерных изображений, как показано на иллюстрациях к этой главе. В 1960-х годах ученые сделали следующий шаг: они стали получать целые серии изображений от множества срезов. Этот метод называется серийной электронной микроскопией. Он дает объемную картинку благодаря совмещению набора двухмерных изображений большого количества срезов. В принципе возможно получить изображение совокупности всех нейронов и синапсов в изучаемом фрагменте мозговой ткани – и даже изображение всего мозга. Это-то нам и требуется для отыскания коннектомов. Однако на практике метод оказывается весьма трудоемким. Срезы трудно получить и поместить под микроскоп, не повредив их (такие повреждения на практике происходят сплошь и рядом). Вероятность ошибки очень велика: ведь даже небольшой фрагмент мозга дает огромное количество тончайших срезов.

Несколько десятилетий ученые не могли решить эту проблему. А потом один немецкий физик предложил простой и гениальный выход из положения.

* * *

Гейдельберг, очаровательный немецкий город примерно в часе автомобильной езды от Франкфурта, совсем не похож на фабрику технологий будущего. Полуразрушенный замок привлекает толпы туристов. Старая часть города вымощена брусчаткой и пестрит барами и ресторанами, где горланят развеселые студенты университета имени Рупрехта и Карла. Если вы чувствуете потребность предаться глубокомысленным раздумьям, отправляйтесь по Философской тропе, на вершину холма. Оттуда открывается великолепный вид на реку Неккер. Здесь витает дух гейдельбергских интеллектуалов прошлого – вспомним хотя бы Гегеля или Ханну Арендт.

Возле одного из мостов через Неккер угнездилось кирпичное строение – Институт медицинских исследований Общества имени Макса Планка (Янштрассе, 29). Здание кажется довольно скромным, однако тут работали пять нобелевских лауреатов! Это один из восьмидесяти элитных институтов при Обществе имени Макса Планка, которое смело можно назвать жемчужиной немецкой науки. Каждым институтом одновременно руководит несколько директоров, и каждый директор распоряжается солидным бюджетом, имеет небольшую армию помощников по науке и вышколенный технический персонал. Общество имени Макса Планка принимает решение в ходе голосования своих членов – нескольких сотен директоров институтов. Это клуб для самых-самых избранных.

Одним из директоров института на Янштрассе, 29 был Берт Сакман, получивший (совместно с Эрвином Неером) в 1991 году Нобелевскую премию за создание «метода локальной фиксации потенциала ионных каналов в клеточных мембранах», ныне – одного из стандартных инструментов нейрофизиолога. Он, в свою очередь, предложил Винфриду Денку стать новым директором института. Тот не отказался.

Денк – мужчина крупный, у него властный вид германского феодала. (Возможно, этому не стоит удивляться, ведь директора институтов Общества имени Макса Планка в каком-то смысле занимают в современном мире такое же положение, какое в Средние века занимали феодальные князья.) Денк поражает и своим остроумием. Научная лаборатория обычно не очень-то притягивает великих комиков, но бывают исключения. Никогда не забуду семинар одного блистательного специалиста по прикладной математике, пересыпанный уморительными шутками касательно секса, наркотиков и рок-н-ролла, я хохотал до колик в животе и до слез, мешавших мне разглядеть уравнения на доске. Афоризмы Денка свидетельствуют о живости его ума. Чтобы их оценить в полном объеме, вам лучше быть «совой», поскольку Денк предпочитает «график Дракулы», вставая поздно и зарабатываясь почти до рассвета. Вы не пожалеете о недосыпе: после полуночи остроты и каламбуры сыплются из него, как из рога изобилия.

В подвале дома на Янштрассе располагаются три электронных микроскопа, надежно укрытые в специальных отсеках от перепадов температуры. В металлических корпусах микроскопов с помощью специальных насосов создан вакуум, чтобы электроны свободно летали, не сталкиваясь с молекулами воздуха. Микроскопы эти немного капризны: то и дело какой-нибудь из них требует ремонта. Но остальные два могут при этом без перерывов сканировать образцы мозговой ткани неделями или даже месяцами.

Денк впервые прибыл в Гейдельберг, уже будучи ученым с мировым именем, он – один из изобретателей двухфотонного микроскопа. (Я уже рассказывал, что этот прибор применяли для наблюдения процессов возникновения и исчезновения синапсов в живом мозге различных представителей подопытной фауны.) Перетряхнув световую микроскопию, он решил автоматизировать серийную электронную. Его идея отличалась простотой: следует делать снимки поверхности образца, обнажаемой при отрезании ломтей, а не получать изображение самих ломтей, которые от нее отделяются.

В 2004 году Денк обнародовал свое изобретение – автоматическую систему, которая представляла собой ультрамикротом, вмонтированный в вакуумную камеру электронного микроскопа. Он назвал свой метод «серийной сканирующей электронной микроскопией основного блока образца». От этого основного блока «отскакивают» направляемые на него электроны, благодаря чему удается получить двухмерное изображение поверхности образца. Затем лезвие ультрамикротома срезает с этой поверхности тоненький слой, тем самым обнажается новая поверхность, и микроскоп делает очередной снимок. Этот процесс повторяется снова и снова. В итоге получают целую стопку двухмерных снимков – похожих на те, что дает обычная серийная электронная микроскопия.

Почему лучше получать изображение основного блока образца, а не срезов? Потому что блок относительно прочен, а срезы очень уязвимы. Даже если бы они не повреждались из-за неправильного обращения, все равно каждый из них чуть-чуть деформируется, причем всякий – по-разному. В итоге объемное изображение получается искаженным. А вот снимки поверхности основного блока образца не содержат таких искажений (или содержат лишь небольшие), поскольку основной блок практически не деформируется при срезании слоев.

Так как ведется съемка поверхности основного блока образца, а не срезов, оказалось возможным поместить ультрамикротом внутрь электронного микроскопа, создав автоматизированную систему, объединяющую в себе и срезание слоев, и построение изображения. Это повысило надежность и точность измерений, исключив чреватую ошибками стадию ручной переноски срезов от ультрамикротома к микроскопу. Срезы, получаемые новым методом, имели толщину всего 25 нанометров – вдвое меньше, чем максимально достижимая при ручном срезании и переносе.

Подобно альпинистам, ученые вечно бьются за приоритет. Слава достается первооткрывателям, а не тем, кто идет за ними. Но наука чем-то похожа и на инвестирование в бизнес-проекты: можно не только опоздать, но и чересчур поторопиться. В своей статье 2004 года Денк признаёт заслуги Стивена Литона, который высказал сходную идею еще в 1981 году. Изобретение Литона в то время не удалось применить на практике, поскольку его микроскоп выдавал бы слишком много информации, ее в ту эпоху просто не смогли бы должным образом обработать. А к тому времени, когда Денк (независимо от Литона) разработал свою методику, компьютеры уже достаточно усовершенствовались, чтобы хранить большие объемы данных.

Как угадать, когда придет время для воплощения той или иной идеи? Тут как с инвестициями: зачастую такие вещи понимают лишь задним числом, когда уже поздно извлекать сверхприбыли. Один из диагностирующих признаков – изобретение, одновременно и независимо совершаемое двумя людьми. Но еще более верная примета – нахождение двух различных решений для одной и той же задачи. Оказывается, кроме Денка были и другие специалисты, которые тоже пытались автоматизировать процесс наблюдения всё более мелких объектов.

* * *

На стенах северо-западного корпуса Гарвардского университета плющ не растет. Их гладкая стеклянная поверхность не дает и намека на историю[14]. Однако это здание находится на переднем крае гарвардских научных изысканий. Войдем в просторный вестибюль, спустимся в подвальный этаж. Перед вашими глазами предстает удивительное, сложнейшее устройство, типичная машина Руба Голдберга[15] (см. рис. 30). Не сразу понятно, куда смотреть. Но тут вы замечаете медленное движение крошечного пластмассового брусочка. Он прозрачен, слегка поблескивает оранжевым и заключает в себе черную крупицу – окрашенный кусочек мышиного мозга.

Рис. 30. Гарвардский ультрамикротом

Некоторые части машины медленно вращаются. С одной катушки на другую перематывается лента, словно в магнитофоне семидесятых годов прошлого века. На столе рядом с машиной лежит еще одна катушка. Вы отматываете с нее немного пластмассовой ленты, смотрите на свет и видите срезы мозга, расположенные на ней с одинаковыми интервалами. Наконец вы понимаете, что функция этого устройства – превращать фрагмент мозга в подобие кинопленки, записывая на ленту один срез мозга за другим.

Делать такие срезы уже само по себе непросто. Собирать их еще сложнее. Как знает всякий повар-любитель, при резке тоненькие ломтики часто прилипают к ножу, а не падают на разделочную доску, как им полагается. В традиционном ультрамикротоме эта проблема решается благодаря кювете с водой. Нож укреплен на одном из ее краев, и отрезаемые кусочки аккуратно опускаются на поверхность жидкости. Затем оператор один за другим осторожно вынимает эти срезы из воды и переносит их под электронный микроскоп для получения снимков. Одно неверное движение – и на срезе появятся неприятные складки или он вообще окажется испорчен и не пригоден для микроскопии.

Рис. 31. Свежие срезы мозга собираются на пластиковую ленту, поднимающуюся из воды

В гарвардском ультрамикротоме, как и в обычном, применяется кювета с водой: с ее помощью полоска срезов мозга стягивается с ножа. Новый элемент – пластиковая лента, поднимающаяся с поверхности воды и напоминающая ленту конвейера. (Ищите эту пластиковую ленту в нижней части фотографии, представленной на рис. 31. Может быть, вам даже удастся разглядеть два среза мышиного мозга, они касаются друг друга краями на вертикальной полоске, идущей по центру ленты.) Каждый срез прилепляется к движущейся ленте и выносится ею из воды на воздух, где быстро высыхает. В итоге мы получаем набор нежных срезов, прилепленных на куда более толстую и прочную ленту, которая и наматывается на катушку. Важная отличительная особенность прибора состоит в том, что он исключает ошибки, связанные с человеческим фактором: оператору вообще не нужно вручную управляться со срезами. А пластиковая лента очень прочна и стойка, ее практически невозможно разрушить.

Первый прототип автоматического ленточного ультрамикротома (АЛУМ) соорудили в весьма скромной обстановке – в гараже, расположенном за тысячи миль от Гарварда, в городе Альгамбра под Лос-Анджелесом. Его изобретатель, Кен Хейворт, – долговязый очкарик с решительной походкой и бойкой речью. Работая инженером в лаборатории реактивных двигателей НАСА, Хейворт конструировал системы внутренней навигации для космических кораблей. А потом он резко сменил поле деятельности и начал участвовать в докторантской программе по нейробиологии в университете Южной Калифорнии. Хейворт невероятно энергичный человек; возможно, именно поэтому в свободное время он, уединившись в собственном гараже, строил новое устройство для нарезания мозга на тончайшие ломтики.

Машина-прототип давала ломтики толщиной 10 микрон: слишком много для электронной микроскопии, но основной принцип все равно удалось продемонстрировать. В один прекрасный день Хейворту позвонил незнакомец. Это был не кто иной, как Джефф Лихтман, гарвардский специалист по изучению процессов самоуничтожения синапсов. Он предлагал сотрудничество. Хейворт устроил в Гарварде мастерскую, где сконструировал еще один АЛУМ, уже способный делать срезы толщиной всего 50 нанометров: такая толщина достижима с помощью обычного ультрамикротома. Лихтман поощрял его к дальнейшему совершенствованию прибора, и в конце концов тот достиг показателя в 30 нанометров. Для того чтобы делать снимки этих срезов, Хейворт привлек к сотрудничеству Нараянана Кастури (которого коллеги обычно называют просто Бобби). О, это была забавнейшая пара! В лаборатории шутили, что Кастури только кажется психом, со своей дикой прической и дикими байками, зато Хейворт – тот настоящий псих. (На подробностях этой шутки, известной лишь посвященным, остановимся позже.) Совместно с еще одним ученым, Ричардом Шалеком, они применяли для построения изображений сканирующий электронный микроскоп – такой же инструмент, какой недавно модифицировал Денк.

Изобретение Денка избавляет от необходимости собирать срезы; изобретение Хейворта делает процесс их сбора надежным. Другие изобретатели разрабатывают собственные схемы усовершенствования процессов изготовления срезов и получения их изображений. Так, Грэм Нотт продемонстрировал, как использовать пучок ионов для испарения верхнего слоя основного блока образца, при этом толщина такого слоя составляет всего несколько нанометров. Эта методика напоминает денковскую, но для нее не требуется алмазный резак. Мне кажется, такие исследования – заря грядущего золотого века серийной электронной микроскопии.

Но с этим золотым веком придут и новые проблемы, которые неизбежно встанут перед нейронаукой. Грядет эра чрезмерного количества информации. Один-единственный кубический миллиметр мозговой ткани способен дать петабайт визуальной информации. Это как альбом цифровых фотографий, содержащий миллиард снимков. Объем мозга мыши – тысяча кубических миллиметров, а мозг человека в тысячу раз крупнее мышиного. Так что усовершенствование процедур изготовления срезов, их сбора и анализа под микроскопом само по себе еще не достаточно для нахождения коннектомов. Съемка каждого нейрона и синапса даст чудовищный вал информации, намного превосходящий способности любого человеческого существа ее осмыслить. Чтобы отыскивать коннектомы, нам потребуются не только машины для получения изображений, но и устройства, которые смогут их видеть.

Глава 9

По следу

Есть древнегреческий миф о царе Миносе, решившем не приносить в жертву прекрасного белого быка, а оставить его себе. Боги, разгневавшись на его жадность, покарали Миноса, вселив в его жену безумную страсть к этому быку. В результате царица произвела на свет Минотавра – чудовище с двумя ногами и двумя рогами. Минос заточил свою неверную жену и ее отродье в Лабиринт, систему запутанных ходов, весьма хитроумно выстроенную великим инженером Дедалом. В конце концов из Афин прибыл герой Тесей и благополучно убил Минотавра. Чтобы найти дорогу из Лабиринта, он следовал за нитью, которой снабдила Тесея его возлюбленная Ариадна, дочь царя Миноса.

Коннектомика чем-то напоминает мне это сказание. Подобно Лабиринту, мозг вынужден иметь дело с последствиями разрушительных эмоций, таких как жадность или похоть. Но при этом он способен побуждать к изобретательности и воспламенять любовь. Вообразите, как вы бродите среди аксонов и дендритов, подобно Тесею, отыскивающему путь по извилистым проходам Лабиринта. Может быть, вы – молекула белка, усевшаяся на молекулярный автомобиль, мчащийся по молекулярному шоссе. Вас везут далеко-далеко: от тела клетки, того места, где вы родились, к пункту вашего назначения – дальнему концу аксона. Вы смирно сидите и наблюдаете, как мимо проносятся стенки аксона.

Если вас заинтересовала перспектива такого путешествия, давайте рискнем проделать его виртуально – не по собственно мозгу, а по его изображениям. Можно проследить путь аксона или дендрита благодаря набору снимков, полученных с помощью устройств, которые описаны в главе 8. Это необходимо для отыскания коннектомов. Чтобы составить карту связей в мозгу, нужно увидеть, какие нейроны соединены синапсами. А это невозможно сделать, не зная, куда идут «провода».

Но чтобы найти весь коннектом, придется исследовать каждый коридор мозгового лабиринта. Для построения карты лишь одного кубического миллиметра мозга придется пропутешествовать через целые мили нейритов, пробраться через петабайт изображений. Столь трудоемкий и тщательный анализ жизненно необходим: поверхностный взгляд на эти снимки ничего вам не даст. Такой способ проведения научных исследований кажется очень далеким от того, чем занимался Галилей, мельком заметивший спутники Юпитера, или Левенгук, немного понаблюдавший за сперматозоидами.

Сегодня наше представление о науке как об умении увидеть, по сути, доведено до предела – благодаря современным технологиям. Более того, в наше время никакой отдельный человек не в состоянии вникнуть во все изображения, получаемые с помощью автоматизированных приборов. Но если технология породила проблему, то, быть может, технология сумеет ее решить? Возможно, компьютерам удастся проследить пути всех аксонов и дендритов благодаря этим снимкам. Если наши машины сделают за нас основную часть работы, мы все-таки сумеем увидеть коннектомы.

Проблема обработки колоссальных объемов информации стоит не только перед коннектомикой. Самый масштабный научный проект в мире, Большой адронный коллайдер (БАК), представляет собой кольцевую трубу, залегающую под землей на стометровой глубине, внутри двадцатисемикилометрового туннеля между Женевским озером и швейцарской частью Юрских гор. Коллайдер (ускоритель) разгоняет протоны до огромных скоростей и сталкивает их друг с другом: это делают, чтобы изучить силы, определяющие взаимодействие между элементарными частицами. На одном из участков этого кольца располагается гигантский аппарат – Компактный мюонный соленоид. Он способен детектировать до миллиарда столкновений частиц в секунду. Одна сотая часть этих столкновений отбирается компьютерами, которые в автоматическом режиме просеивают поступающие данные. Записываются лишь «интересные» события, однако информация течет стремительным и мощнейшим потоком, ведь каждое событие (столкновение) дает больше мегабайта данных. Отобранную информацию затем передают для анализа в сеть суперкомпьютеров, разбросанных по всему миру.

Чтобы находить в мозгу млекопитающих целые коннектомы, нам понадобятся микроскопы, способные делать снимки с такой скоростью, что поток поступающих данных окажется помощнее, чем у БАК. Сумеем ли мы анализировать эти данные с должной оперативностью? Ученые, составлявшие коннектом червя C. elegans, уже столкнулись с этой проблемой. К их большому удивлению, анализировать изображения оказалось труднее, чем получать.

* * *

В середине шестидесятых годов прошлого века Сидней Бреннер, биолог родом из ЮАР, увидел возможность применения серийной электронной микроскопии для построения карты всех связей в сравнительно небольшой нервной системе. Тогда еще не придумали термин «коннектом», и Бреннер говорил о задаче «воссоздания (реконструкции) нервной системы». Он работал в кембриджской лаборатории молекулярной биологии при Совете по медицинским исследованиям. В то время он, как и его коллеги по лаборатории, осваивали C. elegans в качестве стандартного подопытного для генетических исследований. Позже червь стал первым представителем фауны, чей геном удалось полностью расшифровать. В наши дни представителей этого вида червей изучают тысячи биологов.

Бреннер полагал, что C. elegans способен помочь нам понять и биологические основы поведения живых организмов. Червь проделывает самые обыкновенные вещи – питается, совокупляется, откладывает яйца. Кроме того, он дает фиксированный отклик на определенные раздражители. Скажем, если прикоснуться к его головке, он отдернет ее и уползет. А теперь представьте, что вы обнаружили червя, неспособного на какое-то из этих стандартных проявлений. Если его потомство унаследует ту же проблему, можно предположить, что причиной этого стал некий генетический дефект, и попытаться определить, какой именно. Подобные исследования могут пролить свет на связь между генами и поведением, что само по себе было бы очень ценно. Но еще более ценные сведения можно получить, исследуя нервную систему таких червей-мутантов. Не исключено, что удалось бы выявить определенные нейроны или нервные пути, поврежденные из-за воздействия аномального гена. Перспектива всестороннего изучения червя на всех уровнях: гены, нейроны, поведение, – казалась весьма заманчивой. Но осуществление этого плана зависело от одной мелочи: у Бреннера попросту не было карты нервной системы нормального червя. А без нее трудно понять, чем отличается от нее нервная система червя-мутанта.

Бреннер знал об исследованиях немецко-американского биолога Рихарда Гольдшмидта: в начале XX века тот пытался составить карту нервной системы другого вида червей – Ascaris lumbricoides. Но у оптического микроскопа Гольдшмидта не хватило разрешающей способности для того, чтобы ясно показать отростки нейронов или выявить синапсы. Бреннер решил испробовать на C. elegans похожую методику, но с использованием более совершенной техники – электронного микроскопа и ультрамикротома.

Длина C. elegans – всего один миллиметр, этот червь гораздо меньше аскариды, которая способна вырастать до фута в человеческих внутренностях, где она иногда обитает. Чтобы нашинковать крошечную сосисочку C. elegans на слои, достаточно тонкие для электронной микроскопии, требуется сделать несколько тысяч разрезов. Николь Томсон, сотрудник Бреннера, поняла, что всего червя не удастся нарезать без ошибок и погрешностей – процесс нарезки тогда еще не был автоматизирован и представлял немалые технические трудности. Но ученым все же удалось обработать большой фрагмент червя. Бреннер решил скомбинировать изображения, полученные от сегментов нескольких разных червей. Разумная стратегия, ведь нервная система червя довольно-таки стандартизирована (мы говорили об этом раньше).

Томсон кромсала червей, пока не получила срезы для каждой области тела животного. Затем эти срезы один за другим поместили под электронный микроскоп и сделали их снимки (см. рис. 32). Благодаря этому трудоемкому процессу, в конце концов удалось получить набор снимков, представляющий всю нервную систему C. elegans. На снимках были запечатлены все синапсы червя.

Рис. 32. Срез C. elegans

Думаете, Бреннер и его команда остановились на этом? Ведь коннектом – просто совокупность всех синапсов данного существа, разве нет? На самом деле Бреннер с коллегами лишь начали с этого свою работу. Хотя синапсы оказались на виду, их организация по-прежнему оставалась скрытой от глаз человека. В сущности, ученые получили пока лишь мешок с беспорядочной кучей синапсов. Чтобы найти коннектом, следовало выяснить, к каким нейронам относятся те или иные синапсы. По одиночному снимку это сказать нельзя, ведь он показывает лишь двухмерные срезы нейронов. Однако, изучая целую последовательность изображений, показывающих поперечные сечения единичного нейрона через заданные промежутки времени, можно определить, какие синапсы принадлежат данному нейрону. И если это удастся проделать для всех нейронов, то мы как раз и отыщем коннектом. Иными словами, команда Бреннера желала узнать, какие нейроны с какими нейронами соединены.

Опять-таки, представим себе червя миниатюрной сосисочкой. Но на сей раз вообразим, будто сосиска нашпигована спагетти. Эти макаронные нити – нейроны червя, и наша задача – проследить путь каждого из них. Мы не обладаем рентгеновским зрением, поэтому придется разрезать сосиску на множество ломтиков. А потом мы разложим их рядом друг с другом и проследим за каждой нитью, сравнивая ее место на срезах – от одного среза к другому.

Чтобы хоть как-то обезопасить себя от ошибок при таком сравнении, нужно делать чрезвычайно тонкие срезы – меньше, чем диаметр макаронины. Срезы C. elegans должны быть тоньше нейронных отростков, чей диаметр порой не превышает 100 нм. Николь Томсон делала срезы толщиной около 50 нм – как раз достаточно, чтобы с уверенностью проследить путь большинства нейронных ветвей.

Джон Уайт, по образованию инженер-электрик, пытался компьютеризировать анализ получающихся снимков, однако применяемая им технология оказалась слишком примитивной. Уайту и лаборантке Эйлин Саутгейт пришлось обрабатывать снимки вручную. Поперечные сечения одного и того же нейрона помечались одним и тем же номером или буквой (см. рис. 33). Чтобы в полной мере проследить за отдельным нейроном, исследователи ставили одно и то же обозначение на поперечном сечении данного нейрона, различимом на длинной череде последовательно сделанных снимков. (Вспомним, как Тесей постепенно разматывал нить Ариадны, двигаясь в глубь Лабиринта.) А когда удалось проследить нейронные пути, исследователи, вернувшись к синапсам, определили, какие нейроны к ним относятся. Так постепенно стал вырисовываться коннектом червя C. elegans.

В 1986 году опубликованный командой Бреннера коннектом занял целый номер журнала The Philosophical Transactions of the Royal Society of London, издающегося тем самым Королевским научным обществом, которое несколько столетий назад с радостью приняло в свой состав Левенгука. Статья вышла под заглавием «Строение нервной системы нематоды Caenorhabditis elegans», однако в ее колонтитулах стояло более сжатое и выразительное название: «Ум червя». Текст самой статьи – лишь 62-страничный аперитив. Главное блюдо – 277 страниц приложений, где описывались 302 нейрона червя, а также их синаптические связи.

Рис. 33. Выявление маршрутов нейронных отростков путем сравнения их поперечных сечений в последовательно сделанных срезах

Как и надеялся Бреннер, коннектом червя C. elegans помог лучше понять нейронную подоснову различных форм поведения животного. Так, ученые сумели выявить нейронные пути, играющие важную роль в таких моделях поведения, как уже упоминавшееся стремительное уползание червя после касания его головки. Впрочем, лишь небольшая часть амбициозных планов Бреннера сбылась. И не из-за нехватки снимков: Николь Томсон собрала их множество, ибо ей удалось разрезать огромное количество червей. Она даже получила изображения срезов для червей с генетическими дефектами, но задача анализа этих снимков для выявления возможных отклонений в коннектомах этих червей-мутантов оказалась слишком трудоемкой. Бреннер начинал свои исследования, желая проверить гипотезу, согласно которой «умы» червей отличаются, поскольку отличаются их коннектомы, но он не смог этого сделать, поскольку его группа обнаружила лишь один-единственный коннектом, к тому же принадлежащий нормальному червю, а не мутанту.

Впрочем, отыскание даже одного коннектома уже стало великим достижением. Анализ полученных снимков занял у Бреннера и его коллег больше двенадцати лет. Куда меньше труда ушло на то, чтобы делать сами срезы и их снимки. Дэвид Холл, еще один пионер подобных исследований C. elegans, выложил снимки в Сеть на всеобщее обозрение. Это поистине впечатляющее хранилище информации о любимом нейробиологами черве. (Подавляющее большинство данных и сейчас еще не проанализировано.) Тяжкая работа, проделанная группой Бреннера, многими учеными была воспринята как предупреждение: «Ребята, не пытайтесь повторить это дома».

Правда, положение слегка улучшилось в 1990-е годы, когда компьютеры стали дешевле и мощнее. Так, Джон Файэла и Кристен Харрис разработали программу, облегчавшую «ручную» реконструкцию формы нейронов. Компьютер выводил изображения на экран, и оператор мог проводить на них линии с помощью мыши. Эти простенькие функции, знакомые каждому, кто рисовал с помощью компьютера, затем удалось значительно усовершенствовать. Теперь исследователь мог проследить за одним и тем же нейроном, появляющимся во всем наборе снимков: следовало лишь провести границу вокруг каждого поперечного сечения этого нейрона. По мере работы оператора каждый снимок в стопке постепенно покрывался множеством таких границ. Компьютер же следил за всеми границами, принадлежавшими тому или иному нейрону, и выводил результаты трудов оператора в виде окрашенных зон внутри этих линий. Каждый нейрон закрашивался своим цветом, так что пачка снимков походила на трехмерную книжку-раскраску. Компьютер мог также представлять части нейритов в трех измерениях, как показано на рис. 34.

Такой процесс позволил ученым делать свою работу гораздо эффективнее, чем это получалось у группы Бреннера, исследовавшей C. elegans. Теперь изображения аккуратненько складировались на жестком диске, так что больше не приходилось возиться с тысячами фотопластинок. К тому же управляться с компьютерной мышью куда сподручнее, чем с маркером, которым раньше вручную помечали бесчисленные нейроны. Однако анализ снимков по-прежнему требовал участия человеческого разума и по-прежнему занимал массу времени. Применяя свою программу в ходе реконструкции крошечных кусочков гиппокампа и неокортекса, Кристен Харрис и ее коллеги выяснили множество интереснейших фактов об аксонах и дендритах. Однако анализируемые кусочки оказались слишком маленькими, они содержали только миниатюрные фрагменты нейронов. Коннектомы с их помощью найти нельзя.

Рис. 34. Трехмерное представление фрагментов нейрита, реконструированных вручную

Используя опыт этих исследователей, можно путем несложного подсчета заключить: на то, чтобы воссоздать лишь один кубический миллиметр коры головного мозга, потребуется примерно миллион человеко-часов – куда больше, чем ушло бы на получение соответствующих снимков с помощью электронного микроскопа. Это астрономическая цифра. Она дает нам понять, что будущее коннектомики в огромной степени зависит от технологий автоматического анализа изображений.

* * *

В идеальном случае все границы вокруг нейронов на снимках должен прочерчивать не человек, а компьютер. Как ни удивительно, даже современные компьютеры не очень-то хорошо умеют определять, где проходит граница, – даже такая, которая выглядит для нас совершенно очевидной. Компьютеры вообще не очень-то удачно справляются с визуальными задачами. Роботы в фантастических фильмах, привычно оглядевшись, тут же могут опознать все предметы вокруг себя, однако специалисты по искусственному интеллекту (ИИ) по-прежнему бьются за то, чтобы наделить компьютеры хотя бы начатками зрительных способностей.

Рис. 35. «Иллюзорные контуры» треугольника Канижа

В 1960-е годы исследователи в попытках создать первые системы искусственного зрения подключали к компьютерам фотоаппараты. Компьютер старались запрограммировать так, чтобы он превращал фотоизображение в рисунок: такое может легко проделать любой карикатурист. Ученые предполагали, что это будет легко – распознавать объекты на таком рисунке по очертаниям их границ. Тут-то и стало ясно, насколько плохо компьютер умеет видеть края. Даже если фотографировали простые объекты вроде штабелей детских кубиков, компьютеры с большим трудом распознавали границы отдельных кубиков.

Почему эта задача оказалась для электронных устройств почти непосильной? Некоторые тонкости распознавания границ становятся ясны, если обратиться к известной оптической иллюзии – треугольнику Канижа (рис. 35).