Симбиоз с микроорганизмами — основа жизни растений

По данным Е. А. Буш, процесс акклиматизации возделываемых ею сортов картофеля продолжался несколько лет. Очевидно, возрастание микотрофности картофеля в горах — это медленный процесс постепенного накопления симбнотрофных грибов и усиления их жизнедеятельности от поколения к поколению под влиянием особо благоприятных условии фотосинтеза, климата и высокой биогенности черноземных почв на больших высотах. Посланные нами Е. А. Буш вырожденные готические клубни картофеля сорта Коренев с визуально немикотрофных кустов были высажены па высотном стационаре. В первый год растения росли плохо и в их корнях содержалось незначительное количество эндофитов с оценкой в 2 балла. Если бы сильная микотрофность горного картофеля определялась заражением эндофитами в почве, то благоприятное действие этого фактора сказалось бы в первый же год посадки визуально немикотрофного картофеля. Во Франции уже давно по совету специалистов, изучающих микотрофность, лечат больной картофель в горах, повышая его микотрофность.

Более быстрое восстановление микотрофности корней картофеля происходит при посеве его семенами. Этим приемом пользовались многие исследователи, считая, что оздоровление семенных посевов картофеля объясняется иммунностью семян по отношению к вирусным заболеваниям. Обычно в первый год посева вырастают небольшие клубни, которые используются в качестве посадочного материала на второй год, что обеспечивает получение высоких урожаев здорового картофеля (В. И. Эдельштейн, 1957). Последующие клубневые посадки приводят к постепенному уменьшению урожайности и значительному снижению микотрофности картофеля.

Пять раз за лето мы отбирали и просматривали пробы корней картофеля, выращенного из семян и клубней на Овощной опытной станции Тимирязевской академии. У всех изученных сортов (Берлихинген, Смысловский, Катадин, Агрономический и Эпрон) во все сроки микотрофность семенных посевов была на 2 балла выше, чем у клубневых.

При изучении корней картофеля различных сортов, посаженного клубнями на опытных полях Тимирязевской академии и Института картофельного хозяйства (Московская область), была установлена незначительная микотрофность. У сортов Берлихинген, Камераз, Лорх, Юбель, Калев, Северная роза, Смысловский, Приекульский и др. наличие эндофитов в корнях оценивалось в 1 балл, а у кустов с признаками вырождения эндофиты визуально не были обнаружены. Корни картофеля различных сортов, полученные со Львовского сортоучастка, не имели гиф эндофитов, то же отмечалось и у картофеля из южных областей. Значительно более микотрофными (3-4 балла) были различные сорта картофеля в Прибалтийских республиках, где мягкий климат обеспечивал лучший рост растений. Приведенные примеры различной степени микотрофности у картофеля указывают, до каких широких пределов может колебаться интенсивность развития грибного симбионта в корнях одного и того же вида растения в зависимости от экологических условий его произрастания или способа размножения (семенного, вегетативного).

Даже если визуально не удается определить в корнях гиф грибов, везикул, арбускул или спорангиол, нельзя быть уверенным в полной стерильности картофеля по отношению к грибному симбионту, так как в случае образования цветов и семян последние всегда в той или иной степени микотрофны. Как уже отмечалось, картофельные растения из семян значительно более микотрофны по сравнению с клубневыми на одной и той же почве.

Каждый новый сорт картофеля, полученный путем скрещивания через семенную репродукцию, всегда более микотрофен, чем после его длительного клубневого размножения. В этом мы могли убедиться на некоторых сортах Приекульской селекционной станции в Латвии. Привлечение для скрещивании сильно микотрофных диких и горных сортов картофеля может значительно способствовать развитию грибного симбиоза в корнях нового культурного сорта. Ниже мы подробнее остановимся на наших практических предложениях оздоровления культуры картофеля, способствующих повышению ее микотрофности.

В результате изучения микотрофности картофеля, пшеницы и хлопчатника была установлена зависимость между продуктивностью этих культур и степенью их микотрофности, причем последняя устанавливалась нами уже в ранней стадии развития растений, когда об их продуктивности еще нельзя было судить. Это дает возможность предполагать, что степень, микотрофности в какой–то мере определяет урожайность растений.

Указанная закономерность для культурных растений далеко не всегда приложима к природной растительности. Дикие родичи культурных растений, как правило, характеризуются большей микотрофностыо, хотя по продуктивности значительно уступают выведенным на их основе сортам.

Высокая микотрофность. природной травянистой растительности часто при крайне низкой их продуктивности проявляется как защитный фактор, дающий возможность существовать в крайне неблагоприятных условиях. В качестве примера можно привести сильную микотрофность в корнях самого непроизводительного плотнокустового злака Nardus stricla L. (белоуса), который предшествует, по В. Р. Вильямсу (1939), овладению территории гипновыми мхами. Может быть впоследствии будет установлено различие в продуктах синтеза гриба диких и культурных растений.

Заканчивая рассмотрение вопроса о распространении и интенсивности проявления в растительном мире эндомикотрофизма, мы должны подчеркнуть зависимость последнего от условий окружающей среды, наследственных свойств вида и способов размножения растений (вегетативного или семенного). Визуально немикотрофными оказались растения избыточно увлажненных мест, растительность тундры, сухой степи. Во всех этих случаях почвенные и климатические условия ограничивают образование мелкой корневой системы, в которой развиваются симбиотрофные грибы. При изменении условий те же растения становятся микотрофными.

Несмотря на огромное количество данных о симбиотрофизме у растений, наука еще не сделала общего вывода о микотрофном существовании всего растительного мира и тезис о всеобщности и повторяемости основных законов в природе пока еще неприложим к явлению симбиоза растений с грибами. Причины такого положения труднообъяснимы, тем более что микотрофное существование растений установлено и для давних геологических эпох: на многих окаменелостях юрского периода в мельчайших деталях видны грибы в корнях растений. Их фотографии приведены в учебнике А. А. Ячевского (1933) и в работах других авторов.

Непризнание микотрофного существования всего растительного мира определяется другими причинами, нежели недостаточной изученностью этого явления у всех существующих в мире растений. Ведь ни одно положение в ботанике и физиологии растений не устанавливалось при обязательной проверке его на всех растениях. Так, одно из наиболее ценных достижений физиологии растений в наше время, касающееся синтетических процессов в корневых системах растений, было установлено на единичных представителях растительного мира (Сабинин, 1949), что не мешало признать эти процессы как общие для всех растений. Так же была воспринята известная формула Ф. Вента (Went, 1928) об обязательном наличии гормональных веществ у всех растений. То, что оба указанных явления обусловлены деятельностью симбионтных грибов растений, будет показано в следующих главах нашего труда.

Для того, чтобы достигнуть общего признания симбиотрофного существования растений с эндофитами, эпифнтными и ризосферными бактериями, необходим пересмотр основного давно утвердившегося тезиса науки об их автотрофном существовании. Вместе с тем усвоение указанного тезиса с самого первого знакомства с жизнью растений заставляет многих ученых придавать большее значение единичным случаям, в которых эндофиты визуально не были обнаружены, чем длинным спискам растений, у которых наличие грибного симбиоза более чем 100 лет устанавливалось на всех континентах. Микотрофность культурных растений была определена в 20‑х годах нашего столетия.

Что касается указанных единичных случаев, когда у растений визуально не удается обнаружить эндофитов, то, очевидно, для окончательного решения вопроса об их микотрофности нужно обладать более точными методами исследования, тем более, что визуально невозможно установить наличие эндофитов в листьях, хвое, пыльце, семенах в связи с неспецифичностыо их морфологии при отсутствии в их гифах везикул и арбускул, что определяет отличие их от других грибов.

Необходимой предпосылкой разработки таких методов является получение чистых культур эндофитов, чего не удалось добиться многим ученым. Основная трудность здесь заключалась в отсутствии роста эндофитов в стерильных питательных средах, в которых другие грибы хорошо растут.

Нам уже давно удалось установить, что рост эндофитов в стерильных питательных средах возможен только при внесении нескольких капель ростовых веществ микробного или растительного происхождения, после чего они начинают сами их синтезировать. Это позволило нам разработать метод получения чистых культур эндофитов из растений (Гельцер, Коваль, Сапронова, 1965; Гельцер, Кузнецова, 1977). В следующей главе мы остановимся на нем подробнее.

Выводы

1. Литературные данные и результаты наших исследований распространенности эндомикотрофизма в растительном мире свидетельствуют о широком развитии этого симбиоза в природе, которое равнозначно утверждено о его всеобщности.

2. Устанавливаемые исследователями случаи отсутствия, а также ослабления микотрофизма у дикорастущих растений определяются или пониженной биогенностью среды их обитания (тундра, водная среда, пустыня), что ограничивает развитие мелкой корневой системы, или отсутствием гормонального воздействия продуктов метаболизма почвенных и ризосферных бактерий (стерильные опыты).

3. Наиболее сильно развит симбиоз с эндофитами у древесных, кустарниковых и многолетних травянистых растений в условиях, обеспечивающих их высокую продуктивность, в частности в горах, поймах рек, на карбонатных породах.

4. Ослабление микотрофности у однолетних сельскохозяйственных культур обычно связано с понижением их продуктивности при неправильной агротехнике выращивания. Новые высокопродуктивные сорта отечественной селекции не уступают, а часто даже превосходят по микотрофности многолетние дикорастущие растения.

5. Создание и сохранение сильно микотрофных сортов сельскохозяйственных культур должно стать очередной задачей научного земледелия.

2. Происхождение симбионтных грибов и получение их чистых культур

Многие исследователи эндотрофной микоризы растений пытались выделить чистые культуры симбионтных грибов. Неожиданной оказалась невозможность их получения из корней растений, когда уже были известны составы питательных сред для культивирования почвенных грибов. Иногда выделялись грибы из семейства Fusarium или других сапрофитных грибов, которые считали эндофитами растений. К сожалению, эту ошибку повторили и некоторые современные исследователи (Хрущева, 1956; Дорохова, 1970). Ш. Тернец (Tcrnetz, 1907), применив оригинальную питательную среду с добавлением вытяжек из торфа и листьев рододендрона, выделила эндофиты из корней клюквы, брусники, подбела и вереска. Приведенные ею фотографии препаратов (рис. 9) убеждают, что под микроскопом она наблюдала прорастание характерных многоклеточных симбионтных грибов. Однако из–за ненадежной стерилизации поверхности корней 1%-иой соляной кислотой в качестве чистой культуры выделился быстрорастущий фикомицетный гриб Phoma, который Ш. Тернец и в дальнейшем М. Рейнер (Rayner, 1925) считали настоящим эндофитом, так как он способствовал заражению молодых сеянцев эндофитами и заметно усиливал рост их корней. Данные, полученные этими авторами, длительно обсуждались в научной литературе и были признаны ошибочными, но их питательные среды еще долго использовались исследователями.

Рис. 9. Прорастание эндофитов из клеток эпидермиса корней различных растений (по Ternetz, 1907)

X. Вольф (Wolff, 1926) выделил многоклеточный мицелий грибов из корней Neottia nidus avis и некоторых других зеленых орхидей на средах с глюкозой, пептоном, вытяжками из гумуса и листьев граба. Этот исследователь впервые заметил очень важную особенность эндофитов: их лучший рост в жидких питательных средах, чем на твердом агаре, что подтверждает их адаптацию к плазме растительной клетки. У Вольфа мицелий эндофитов обычно рос глубинно и только изредка возникал воздушный мицелий со спорангиями на поверхности питательной среды, что, но нашему убеждению, указывало на загрязнение чистых культур эндофитов, которые никогда не образуют воздушного мицелия. Примененный автором метод стерилизации корней был оригинален, но ненадежен. Для освобождения от поверхностных плесневых грибов автор помещал корни в питальный раствор Кнопа и после прорастания и удаления наружных грибов промывал корни спиртом. Процедура повторялась 3 раза, что не всегда избавляло препараты от загрязнения другими грибными культурами.

До сих пор выделение чистых культур эндофитов удавалось немногим исследователям, которые сами не могли установить основную причину успеха. Так, Р. Фрейслсбен (Freisleben, 1933, 1936) пытался выделить чистые культуры эндофитов из 42 растений, но ему удалось получить их только в одном случае из сильно микотрофного растения черники (Myrlillus). У этого эндофита не было спороносящих органов размножения, и он состоял из многоклеточного мицелия. При заражении эндофитом семян различных растений у них повышалась всхожесть, усиливались рост растений и развитие микоризы. Е. Поммеру (Pommer, 1959) удалось выделить многоклеточный эндофит из клубеньков ольхи (Alnus glutinosa) на обычной питательной среде, обогащенной соком из поверхностно стерильного клубенька этого растения после освобождения его от кожицы. До Поммера из клубеньков ольхи некоторые исследователи выделяли только актиномицеты, которые являются необязательными их компонентами. Автор подчеркнул медленный рост эндофитов и гранулированное строение их плазмы, а также образование везикул. При заражении стерильно выращенных проростков ольхи чистой культурой эндофитов на их корнях через 4-6 недель образовались клубеньки, тогда как у контрольных растений они не возникали. Это, по мнению автора, доказывало, что появление клубеньков у небобовых растений определяется грибами, а не актииомицетами. Однако Поммеру не удалось на основании своего метода выделить эндофиты из клубеньков других небобовых растений.

А. Келли (1952) считал, что в природе не существует специальных микотрофных грибов, а имеется только «микоризное состояние» любых почвенных грибов, обладающих способностью интенсивно внедряться в ткани растений. Этим недоказанным утверждением А. Келли оказал плохую услугу науке о симбиотрофном существовании растений, поскольку многие исследователи восприняли данное ошибочное положение как аксиому. Отрицание специфичности и особой ферментативной направленности у различных микроскопических грибов противоречит успехам, достигнутым технической микробиологией в синтезе определенных органических веществ или антибиотиков.

Некоторые ботаники считают возможным перерождение симбионтных грибов в паразитарных и наоборот. Однако это утверждение явно ошибочно, так как такое перерождение должно сопровождаться перестройкой их ферментативного аппарата в процессе выполнения противоположных по своему характеру действий. Также нельзя согласиться с указаниями Б. Моссе (Mosse, 1969, 1973), что симбионтными грибами являются фикомицетные эндогоновые грибы, разлагающие лесную подстилку. Если бы эти грибы действительно заразили растение, то они произвели бы в нем такую же разрушительную работу, как в подстилке. Б. Моссе в противоположность своим предшественникам Ш. Тернец (Ternetz, 1907) и М. Рейнер (Rayner, 1929) придерживалась теории заражения корней растений эндофитами в почве, так как, по ее представлениям, генеративные органы растений не содержат эндофитов, что было ошибочно подтверждено и Л. В. Крюгер (1969). Для заражения Б. Моссе предпочла использовать сапрофитный фикомицетный гриб из семейства Endogonaceae. Заражение стерильных семян различных растении спорокарпиями этого гриба приводило иногда к желаемым результатам, и в корнях опытных растений образовывалась, по ее мнению, «везикулярно–арбускулярная фикомицетная микориза». Б. Моссе (Mosse, 1969) усиливала заражаемость эндогоновыми грибами, включая ризосферную бактерию из рода Pseudomonas, после чего получила более убедительные доказательства значения поверхностного заражения стерильных семян для образования эндотрофной микоризы фикомицетного типа.

Ни Б. Моссе, ни ее последователи в нашей стране Л. В. Крюгер и И. Л. Селиванов (1976), включая в процесс заражения новый фактор — ризосферные бактерии, не определили отдельно степень участия данного фактора в образовании указанных микориз. Между тем это избавило бы исследователей от необходимости проводить кропотливую работу по разработке метода получения эндогоновых грибов из лесной подстилки, так как желаемая микориза образовалась бы при действии одной ризосферной бактерии, вместе с чем отпала бы необходимость считать ее фикомицетной.

Вряд ли теоретически можно допустить, что сапрофитные грибы, обладающие набором ферментов для разрушения мертвых растительных остатков лесной подстилки, способны осуществлять в корнях растений многочисленные синтетические процессы, поскольку такая универсальность несвойственна микроорганизмам.

Для окончания затянувшейся на несколько десятилетий дискуссии о природе и происхождении грибных симбионтов растений назрела необходимость в разработке метода выделения чистых культур эндофитов с целью установления их морфологии, физиологии, происхождения и сущности взаимосвязи с растениями. Неудачные опыты многих исследователей, предпринимавших попытки решить этот вопрос, заставили нас искать новые пути получения таких культур.

Метод выделения эндофитов. Наша работа по выделению чистых культур эндофитов из корней растений была начата с выяснения надежной стерилизации поверхности корней, не нарушающей жизнедеятельности находящихся внутри них живых организмов. Было установлено, что применение 2-3‑минутной обработки тонких корешков сулемой в концентрации 1 : 1000 и последующая отмывка сулемы спиртом и многократно стерильной водой обеспечивают стерильность поверхности корня и не нарушают жизнеспособности эндофитов. Это же достигается при короткой обработке 30%‑ной перекисью водорода.

Состав питательной среды. После долгих поисков мы остановились на следующей буферной питательной среде (г на 1 л воды): глюкоза — 8; К2НРО4 — 0,3; КН₂Р0₄— 0,9; MgS0₄ — 0,2; K₂SО₄ — 0,1; FeS0₄ и MnS0₄ — следы, аспарагин — 0,01.

Нам удалось также установить основную особенность симбионтных грибов растений — их потребность в ростовых веществах в короткий период прорастания из растительной ткани в питательную среду и, как мы увидим дальше, в процессе прорастания из семени в корень, В обоих указанных случаях без наличия гормонального воздействия извне эти грибы не прорастают (Гельцер, 1973а, б). В редких случаях при сильной микотрофности растений и, очевидно, достаточной концентрации гормональных веществ в тканях их корней, а также при небольшом разведении питательной среды эндофиты прорастают без добавления ростовых веществ. Так были получены чистые культуры эндофитов из черники (Freisleben, 1936), корней зеленых орхидей (Wolff, 1926) и из ирисов в наших опытах.

В качестве ростовых веществ могут быть использованы спиртовые вытяжки из различных гименомицетов и фитобактериомицета, который изготовляется из актиномицета (Actinomyces lavendulae), ризосферных бактерий или наших препаратов, изготовленных из эндофитов и получивших авторские свидетельства: Симбионт I (Гельцер, 1973а) и Симбионтм2 (Гельцер, Игнатьев, 1982). Во всех случаях количество добавляемых в питательную среду ростовых веществ должно быть минимальным при экспериментально установленной концентрации препарата.

За исключением указанной особенности эндофитов, нами не выявлено каких–то их особых требований к составу питательных сред. В качестве энергетических веществ эндофиты хорошо усваивают глюкозу, сахарозу и крахмал, но неспособны использовать органические кислоты (кроме янтарной), целлюлозу и лигнин.

Заканчивается подготовка к выделению чистых культур эндофитов внесением в каждую колбочку гормональных веществ (по 2-3 капли препарата Симбионтм1 или других активных веществ). После прорастания мицелия эндофитов, которое происходит через 5-12 суток, для освобождения от корней мицелий пересевают в колбы с указанной питательной средой без добавления гормональных веществ, которые грибы синтезируют сами. Так как эндофиты обладают азотфиксацией, то применение минимальных доз азота сохраняется и для их дальнейших пересевов, чтобы при многолетнем культивировании этих грибов в лаборатории не нарушать их способности использовать атмосферный азот, о чем мы подробно расскажем в главе 3.

Чистые культуры эндофитов. Разработанная методика выделения эндофитов обеспечивает получение их чистых культур из любых растений, т, е. из сильно и слабо микотрофных, а также растений, считающихся не микотрофными из–за того, что визуально в их корнях под микроскопом эндофиты не были обнаружены.

Мы выделили чистые культуры эндофитов из корней следующих водных растений: рдестов (Potamogeton natans L.), тростника (Phragmites communis Trin.), белокрыльника (Calla palustris L.) и рогозы (Tipha latifolia L.). Замедленный рост и слабое наращивание мицелия заметно отличают чистые культуры водных от сильно микотрофных сухопутных растений, описание которых приводится ниже.

Мать–и–мачехa (Tussilago farfara L.). Эндофиты из корней этого растения ежегодно выделялись в нашей лаборатории па протяжении 9 лет и постоянно получались одинаковые результаты. Четко септированный многоклеточный мицелий, заполненный зернистой плазмой, никогда не спороносит. При старении в мицелии образуются круглые везикулярные вздутия (рис. 10), хорошо окрашиваемые анилин–бляу. Мицелий гриба в жидких средах растет погружённо, образуя студенистую массу вначале темно–зеленого цвета, а в дальнейшем — черного. Пигмент не переходит в раствор. Эндофиты, выделенные из молодых завязей этого растения, окрашены в золотисто–желтый цвет, как и его цветок.

Рис. 10. Везикулы о старом мицелии чистой культуры эндофитов из корней мать–и–мачехи

Вишня (Primus cerasus L.). Эндофит из корней вишни ежегодно выделялся в течение 8 лет. Сильно септированный мицелий с гранулированной плазмой золотистого цвета выделяет в раствор пигмент густо–вишневого цвета. Много шарообразных везикул, образующих цепочки. Спороносящие органы не обнаружены. При нагревании до 60° мицелий теряет жизнеспособность. В жидких средах растет погруженно.

Облепиха (Hippophae rharnnoides L.). Чистая культура эндофита 2 года выделялась из клубеньков и корней. Многоклеточный четко септированный мицелий. иногда с веретенообразными клетками, заполненными гранулированной плазмой. Мицелий преимущественно выделяет коричнево–бурый пигмент.

Клевер (Trifolium pratense L.). Отличительной особенностью эндофитов этого растения, ежегодно выделявшихся нами в течение 7 лет, является хрупкость молодого мицелия, который легко обламывается, при этом кусочки гиф накапливаются на дне колбы. Извлеченные стерильным капилляром, такие отрезки гиф в новой питательной среде образуют такой же мицелий с отпадающими отростками. Многоклеточный мицелий клевера синтезирует красный пигмент. Плодоносящие органы не наблюдались.

Пшеница (Triticum vulgare Vill.). Ежегодно выделялись в течение 5 лет эндофиты из корней разных пшениц. Сильно септированный мицелий образует рыхлую массу, обычно окрашенную в красный цвет. При старении на концах гиф образуются везикулярные вздутия. Рост гриба в жидкой среде погруженный. Плодоносящие органы не наблюдались.

Ирисы (Iris germanica L.). Эндофиты из корней растения ежегодно выделяли 8 -лет. Многоклеточный мицелий в начале роста с удлиненными, а в дальнейшем — с почти круглыми клетками, заполненными гранулированной плазмой, при старении образует темно–зеленую слизистую массу. Иногда мицелии был окрашен в розовый цвет, что, очевидно, зависит от сорта растения. Плодовые органы не наблюдались. При нагревании мицелия до 60° он терял свою жизнеспособность.

Любка (Platanthera bifolia Rchb.). Топкие, слабо септированные гифы при старении образуют четко септированный мицелий (рис. 11). Его отличительной особенностью является белый цвет. За 7 лет выделении эндофитов только один раз мицелий был окрашен в черный цвет. При погруженном росте плодоносящие органы не наблюдались.

Рис. 11. Мицелии чистой культуры эндофита из корней любки

Вереск (Calluna vulgaris Salisb.). Эндофит этого растения выделялся б лет. Четко септированный мицелий, заполненный гранулированной плазмой, растет погружен но. При старении гифы темнеют и приобретают, как и у всех сильно микотрофных растении, темно–зеленый или черный цвет. Эпдофит, выделенный из цветущей ветки этого растения, синтезировал фиолетовый пигмент. В остальном все так же, как у вышеописанных культур.

Можно было бы представить более 100 подобных описаний чистых культур эндофитов, в которых варьировала бы окраска пигментов и их способность переходить или не переходить в раствор. Эндофиты синтезируют пигменты всех цветов. Так, гриб, выделенный из герани, всегда окрашивался в желтый цвет, но однажды оказался фиолетовым. Выяснилось, что эта герань цвела фиолетовыми цветами.

Общими морфологическими показателями для всех выделенных чистых культур эндофитов были следующие: 1) отсутствие спороносящих органов размножения; 2) многоклеточный мицелий, принимающий по мере старения четко септированную форму с везикулярными расширениями; 3) гранулированная плазма, рассыпающаяся при разрыве оболочки клетки; 4) погруженный рост в жидкой среде при отсутствии поверхностного мицелия; 5) способность синтезировать пигменты разных цветов.

Отличие в развитии мицелия у водных растений заключалось в крайней медлительности их роста в первый год выделения в питательных средах. Только после многих пересевов на протяжении года в богатых углеводами средах они уже ничем не отличались от симбионтных грибов сухопутных растений. Создавалось впечатление, что в корнях водных растений эндофиты голодали и понадобился год частых пересевов в богатых углеводами питательных средах для того, чтобы придать им характерную форму, обычную для эндофитов сухопутных растений.

Разработанная методика получения чистых культур настоящих эндофитов открывает широкие возможности для развития науки о симбиотрофном существовании растительного мира. Ее применение способствует устранению многих спорных вопросов, обременяющих изучение грибного симбиоза растений.

Во введении к разделу об эндотрофной микоризе Дж. Харли (1963, с. 134) сообщает, что «наиболее ярким признаком, позволяющим разделить все типы эндотрофной микоризы на две большие группы является членистость (септированность) их гиф. Гифы могут быть септированными, как у аскомицетов, несовершенных грибов и базидиомицетов, или, наоборот, несептированными, например, у фикомицетов». Это утверждение как бы обобщает выводы различных авторов по данному вопросу, поскольку одни твердо убеждены, что эндофиты принадлежат к фикомицетам, а другие — к несовершенным грибам гифомицетам. Никто из авторов не установил, что определенным семействам растений соответствует один из двух указанных видов грибов. Напротив, дли семейства злаковых растении одни исследователи отмечали наличие септированного мицелия, а другие — несептированного. Очевидно, это расхождение определялось тем, что авторы выделяли из корней пшениц разные грибы. Мы всегда наблюдали в корнях всех растений у хорошо развитого мицелия только многоклеточное строение эндофитов, что подтвердилось при выделении их чистых культур.

При микроскопическом изучении выявление перегородок у мицелия эндофитов, растущих в тканях растений, представляет известные трудности даже после мацерации препаратов в щелочи. В молодых гифах перегородки плохо просматриваются в препаратах. В старых гифах, образующих клубки и петли, они видны отчетливо. Дж. Харли (1963) считал, что микориза у злаковых и бобовых растений относится к фикомицетному типу. Выделенные нами дополнительно для проверки его утверждения чистые культуры эндофитов из люцерны, гороха, вики, акации и бобов всегда имели многоклеточный мицелий, как и эндофиты из ржи, овса, тимофеевки, ежи, пырея и кукурузы. Многие исследователи, применив электронный микроскоп, подтвердили многоклеточную природу эндофитов.

Из всего изложенного следует, что обычно принятое и уже ставшее трафаретным положение о наличии у растений «везикулярно–арбускулярной фикомицетной микоризы» не соответствует действительности и не может быть признано научно доказанным.

Многоклеточное строение гиф эндофитов не дает основания причислить их к роду Rhizoctonia, от которых они отличаются как по морфологическим, так и по физиологическим свойствам. Сравнивая мицелий эндофитов с Rhizoctonia solani u R. ailcrholdii, выращенных в одинаковых по составу питательных средах, можно установить, что последние не образуют везикулярных вздутий, не имеют гранулированной плазмы, как эндофиты, и не синтезируют пигменты. Кроме того, обе культуры Rhizoctonia не обладают азотфиксирующей способностью и не синтезируют гормональных веществ. Все указанные различия заставляют отказаться от причисления эндофитов к указанному роду.

Многовековая адаптация эндофитов к растительной клетке, постоянство морфологических признаков при выполнении ими определенных функций, в том числе и защитного характера (см. главу 5), исключают участие в этом сложном взаимодействии случайного сообщника при заражении корней в почве естественным путем или исследователем в эксперименте. Отсутствие спороносящих органов заставляет отнести эндофиты к классу несовершенных грибов (Fungi imperfecli), где они могут быть выделены в особый порядок симбиофитов — Symbiophytum, отличительной особенностью которых могут являться их морфология и физиологическая способность к синтезу определенных соединений.

Метод получения чистых культур эндофитов из корней растений дал возможность не только составить правильное представление об их морфологии, по и обнаружить наличие эндофитов в корнях тех немногих растений, у которых из–за слабого развития симбионта он не мог быть визуально обнаружен под микроскопом.

Нам предстояло использовать этот метод для решения еще одного вопроса — вопроса о наличии эндофитов в надземных частях растений, что необходимо для доказательства наследственной передачи симбионтных грибов от семени к семени.

В руководимой нами лаборатории О. И. Громыко установила, что чистые культуры эндофитов хорошо выдерживают лиофильное высушивание и длительно сохраняют свою жизнеспособность в сухом состоянии. При прорастании в питательных средах с ростовым веществом они синтезируют пигменты тех же цветов, которые были им свойственны до сушки. Как известно, мицелий плесневых грибов не выдерживает лиофилизации.

Наличие у эндофитов в корнях растений гиф с такими характерными образованиями, как везикулы, арбускулы и спорангиолы, в которых накапливаются белковые продукты их синтеза, хорошо окрашиваемые аиалин–бляу в фиолетовый цвет, а также расположение гиф вдоль коровой паренхимы не оставляют сомнений и их принадлежности к симбионтным грибам.

В мацерированных щелочью листьях и хвое различных растений обнаруживаются слаборазвитые гифы грибов, но их признаки еще не определяют принадлежности к эндофитам.

В книге, посвященной биологии микориз, Дж. Харли (1963), приводя мнение многих авторов о наличии эндофитов в надземных частях растений, подчеркивал его недостоверность, так как все авторы отмечают «ослабленное» состояние гиф в листьях. Только применяя метод выделения чистых культур эндофитов, можно решить вопрос о присутствии симбионтных грибов в надземных частях растений.

Листья и хвоя растений стерилизовались сулемой, спиртом и промывались стерильной водой, после чего их помещали в стерильные чашки Петри с небольшим количеством питательного раствора и 1-2 каплями ростового препарата Симбионт I. Одновременно стерильность листьев проверяли на твердых питательных средах. Спустя 10-15 дней эндофиты из листьев прорастали, что отчетливо просматривалось в микроскопических препаратах, а еще через несколько дней стало возможным выделение их чистых культур. Последние были получены из листьев таких сильно микотрофных растений, как вереск, мать–и–мачеха, брусника, черника, дуб, ольха, липа и др., а также из слабо микотрофных растений картофеля и пшеницы.

В первый период роста мицелий из листьев заметно отличался от мицелия из корней простотой своего строения, малой разветвленностью гиф и слабо очерченными перегородками. Только при длительном культивировании в лабораторных питательных средах с пересевами через каждые 2-3 месяца гифы становятся более разветвленными и широкими, с четко очерченными перегородками и гранулированной плазмой, с везикулярными вздутиями, характерными для эндофитов из корней. Скорость изменения строения гифов определяется степенью микотрофности растений. Для выделения эндофитов из листьев дуба, липы, ольхи, вереска, мать–и–мачехи и других сильно микотрофных растений достаточно было несколько месяцев, тогда как эндофиты из листьев слабо микотрофных растений нуждались в культивировании в течение 1-2 лет (рис. 12). Становится очевидным, что «ослабленное» состояние и «упрощенное» строение эндофитов определяются их неспособностью использовать для питания продукты фотосинтеза листа или отсутствием последних в листе. Возможно, упрощенность функций эндофитов в надземных частях растений связана с отсутствием у них везикул, арбускул и гранулированной плазмы, а основное их назначение сводится к наследственной передаче симбионтных грибов в пыльцу и семена.

Рис. 12. Строение эндофитов» выделенных из листьев стерильно выращенной ольхи (1); та же культура через 1 (2) в 2 года (3)

Достоверность результатов выделения чистых культур эндофитов из листьев была проверена в нескольких стерильных опытах, в которых применялись широкогорлые колбы, заполненные на одну треть силикагелем с питательной средой и закрытые ватной пробкой (в силикагеле лучше, чем в песчаной среде, развивается мелкая корневая система растений, благоприятная для развития эндофитов (Гельцер, 1966). Подопытными растениями были просо, ольха и облепиха, стерильность семян которых проверялась перед посевом на твердых питательных средах. При хорошем освещении растения выращивались 45—60 дней. Контрольные семена намачивались в стерильной воде, а в опытных вариантах — в растворе ростового препарата фитобактериомицина (ФБМ) разных концентраций.

После вскрытия стерильных опытов в контрольных вариантах эндофиты не были обнаружены ни в корнях, ни в надземных частях растений, а в опытных они были выделены и из листьев, и из корней, при этом гифы эндофитов имели весьма четкие везикулярные вздутия; на корнях ольхи и облепихи образовались присущие им клубеньки (рис. 13). Очевидно, нет необходимости применять к стерильным семенам заражение какими–либо грибами. Подробнее на рассмотрении этого вопроса мы остановимся в дальнейшем.

Рис. 13. Клубеньки на корнях облепихи, выращенной из семян, обработанных ФБМ

Необходимо отметить еще одну особенность эндофитов из листьев. Они при длительном культивировании в питательных средах начинают синтезировать цветные пигменты, что характерно для чистых культур эндофитов из корней (Гельцер, 1975). Так, эндофиты из листьев цветущего вереска вскоре начали синтезировать фиолетовый пигмент, из листьев липы (через год после их выделения) — желтый пигмент, характерный для ее цветов.

Несколько культур эндофитов было выделено из завязей липы, яблони, вишни и золотистой смородины. В этом случае для эксперимента нужно брать молодые, недавно образовавшиеся завязи. В отличие от мицелия из листьев растений мицелий из завязей вскоре после своего разрастания синтезирует характерный для данного растения пигмент и по своей морфологии больше соответствует мицелию из корней. Так, колонии эндофитов из завязей липы и яблони были окрашены и ярко–желтый цвет.

Наличие симбионтных грибов в молодых завязях определило необходимость изучения самого сложного органа растения — цветочной пыльцы, которую нельзя подвергнуть поверхностной стерилизации, так как при всех применяемых для этого приемах она теряет способность к прорастанию. Легкая стерилизация возможна только для пыльцевого мешка с последующими стерильными приемами сбора пыльцы. Способность эндофитов к анабиозу подтверждает возможность их существования в пыльцевой клетке без стадии визуально наблюдаемого мицелия. Основным условием, определяющим прорастание эндофитов из растительных клеток, является наличие в питательных средах или окружающих клетках гормональных веществ. При попадании пыльцы на рыльце пестика она получает гормональное воздействие, которое вызывает ее прорастание.

Пыльцевые клетки проращивались многими генетиками, но применение ими несовершенных питательных сред, состоящих из сахара и бора, но без ростовых веществ, всегда обеспечивало развитие только первой стадии их прорастания образование пыльцевой трубки и выход плазмы, содержащей спермин. Вторая стадия — прорастание симбионтных грибов в природных условиях — происходит только при попадании пыльцы на рыльце пестика, который обладает гормональным воздействием.

Для выделения эндофитов из пыльцы в лабораторных опытах мы применяли указанную выше питательную агаровую среду. После застывания этой среды в чашках Петри ее поверхность обрабатывал и янтарной кислотой для предохранения от бактериального заражения. Пыльцевые клетки наносили в нескольких местах и смачивали их гормональным препаратом Симбионт 1 и разбавлении 0,0001. В таких условиях эндофиты пыльцы прорастали.

С. Г. Навашин (1951) установил, что прорастание пыльцы начинается с роста пыльцевой трубки и выделения из нее плазмы спермия во внешнюю среду. В наших опытах этот процесс всегда предшествовал развитию грибного мицелия. В тех случаях, когда пыльцевая трубка не прорастала или содержимое пыльцы не переходило наружу, мицелий гриба не развивался. При наличии водной пленки на поверхности агара в чашках Петри выделившееся из пыльцы плазменное содержимое переносится током жидкости на некоторое расстояние от клетки, создавая впечатление независимого от нее процесса развития грибного мицелия. При подсушке поверхности агара эндофиты прорастают непосредственно около выделившейся плазмы. На рис.14 и 15 видно развитие эндофитов у пыльцы лилии и крокусов.

Рис. 14. Прорастание пыльцы лилия

Рис. 15. Прорастание пыльны крокуса

Наблюдаемая последовательность в фазах развития пыльцы исключает возможность объяснения образования мицелия в результате воздушного загрязнения, не говоря уже о том, что специалист, изучающий чистые культуры эндофитов, не может принять за эндофиты плесневые спороносящие грибы.

Через 1-2 дня после прорастания пыльцевой клетки образуется характерная по своему габитусу многоклеточная грибная колония эндофита. Вначале молодые гифы состоят из удлиненных клеток, заполненных зернистой плазмой с четко очерченными перегородками. При прорастании пыльцы ярко окрашенных цветков, таких как у настурции, георгина или красной лилии, мицелии эндофитов приобретает оранжевый оттенок, но уже на 3-4‑й день он становится темно–зеленым. К этому времени клетки мицелия принимают округлую септированную форму и гифы распадаются на отдельные сегменты. Такую способность к распаду гиф на отдельные клетки, а также быстрый переход удлиненных клеток в бусовидные, мы не наблюдали у других эндофитов, выделенных из других частей растений. На рис.16, 17 видны септированные гифы из пыльцы огурцов и томатов.

Рис. 16. Септированные гифы из пыльцы огурцов