Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов

Рис. 2. Иллюстрация к определению основных ‘параметров формы эритроцитов (пояснение в тексте)

Величины для концентрации гемоглобина и его ‘массы в эритроцитах были получены для эритроцитов, переведенных в сферическую форму. Величина ∆n связана с объемной концентрацией внутриклеточных веществ (гемоглобина)– Cv ( Feleppa ‚ 1972) . Отсюда для концентрации гемоглобина имеем: Cv = ∆n/α, где α – характеристический коэффициент, определяемый оптическими свойствами вещества.

Масса гемоглобина m, определяется как произведение концентрации гемоглобина на, объем эритроцита. Для клеток сферической формы получаются простые выражения для Сv и m

Cv = 1,344 (∆Y max/S R) (2)

m = 5,63 ∆Ymax./S (3)

Где ∆Y max – максимальное отклонение интерференционной полосы, проходящей через центр эритроцита, S – расстояние между полосами вне клетки, R – радиус эритроцита.

Наблюдение эритроцитов в проходящем и отраженном пользованием лазерного освещения, с использованием микрокиносъемки и видеозаписи , позволило получить новые данные о процессах, преобразования формы эритроцитов от диска к сфере. Интерферограммы эритроцитов, полученные при их исследовании в отраженном свете, позволили наблюдать активное движение внутри эритроцитов в переходной стадии преобразования формы клетки (Рис. 6).

Проделанные в работе расчёты разрешающей способности лазерной микроскопии, оценка чувствительности голографической интерферометрии, определение погрешностей измерений, параметров формы и массы эритроцитов, показали, что предложенные методики оценки со стояния живых, нефиксированных эритроцитов расширяют возможности традиционных методов цитологического анализа и могут быть успешно использованы для количественных и качественных исследований эритроцитов и других типов клеток.

2. Сравнительная характеристика свойств эритроцитов по данным голографической интерферометрии и’ лазерной микроскопии в норме и патологии

В этой серии исследований эритроциты в аутоплазме сохраняли нормальную форму до конца эксперимента. Нами наблюдалось наличие неоднородности в распределении эритроцитов в зависимости от диаметра. Во всех обследованных группах детей /здоровых, больных диффузным гломерулонефритом, сахарным диабетом, наследственным сфероцитозом /НС/ наблюдалось полимодальное распределение эритроцитов.

Средние значения отдельных мод не зависели от вида патологии. Было выделено 5 средних модовых значений диаметров эритроцитов: 6,75 мкм, 7,45 мкм, 8,20 мкм, 8,80 мкм, 9,40 мкм. Процентное распределение эритроцитов по этим группам показало, что в норме 51,5% клеток относятся к группе со средним диаметром 8,20 мкм. При сахарном диабете зв этой группе находится 16,0% клеток, и 63,04 со средним диаметром 8,80 мкм. При гломерулонефрите менее выражено наличие центрального пика (38,5% со средним диаметром 8,20 мкм, 32,5% 8,80 мкм). При наследственном микросфероцитозе 35,0% эритроцитов имеют средний диаметр 8,20 мкм, и значительное число клеток малого диаметра (37,5# 7,45 мкм, 27,24 6,75 мкм). В отдельных случаях вместо полимодального распределения эритроцитов наблюдались две достоверно различающиеся группы (Р <0,05).

Сравнение эритроцитов по размерам: диаметр, толщина, площадь поверхности, объем, коэффициент сферичности, по параметрам формы Кϕ, К эл. С/R , по массе и концентрации гемоглобина в клетках не выявило значительных различий между группами здоровых детей и детей больных диффузным гломерулонефритом и сахарным диабетом. Популяции эритроцитов периферической крови здоровых детей и детей больных НС достоверно различались по всем параметрам (Р‹0,05) . (Таблица 1.) кроме объема, коэффициента С/R, массы (30,9 ± 1.1 пг, 29,1± 0,8 пг) и концентрации гемоглобина в клетках (36,6± 1,45%, 38,2± 1,46%).

Эритроциты, помещенные в аутоплазму, как в норме, так и при НС наблюдались в виде дисков, собранных в "монетные столбики". Истинные сфероциты при НС полностью отсутствовали, хотя они присутствовали в сухом мазке, как клетки уменьшенного диаметра. Средняя величина объема эритроцитов при НС практически совпадает со средней величиной объема эритроцитов в норме, а площадь поверхности снижена. Уменьшение площади поверхности эритроцитов при неизменном объеме приводит к разбуханию клеток при НС, что характеризуется сниженной величиной коэффициента сферичности: отношение площади поверхности к объему равно 1,22, в норме 1,65. Снижение коэффициента сферичности за счет уменьшения площади поверхности приводит к снижению осмотической резистентности эритроцитов при НС.

Рис. 3. Иллюстрация связи осмотической резистентности эритроцитов с коэффициентом сферичности. Пояснение в тексте.

Кривые осмотического гемолиза: Nг – число погибших эритроцитов в %, С NaCl концентрация хлористого натрия.

Распределение эритроцитов Nэ в % в зависимости от их коэффициента сферичности (S/V). Сплошная линия – норма, точечная – НС. Сдвиг кривой распределения эритроцитов в сторону меньших значений отношения S/V соответствует сдвигу кривой осмотической резистентности эритроцитов в сторону больших концентраций NaCl, что указывает на снижение осмотической резистентности при НС.

Кроме измерения средних величин методы голографической интерферометрии и лазерной микроскопии позволяют исследовать отдельные эритроциты одновременно по нескольким параметрам. Это позволяет выявлять характер соотношений между различными количественными характеристиками эритроцитов внутри популяции. Исследования показали наличие общих свойств эритроцитов в норме и при наследственном микросфероцитозе. Так, зависимость площади поверхности эритроцитов от их диаметров имеет общий вид в обоих случаях (Рис. 4).

Рис. 4. Зависимость площади поверхности S от диаметра эритроцитов /D/ в норме /ᴏᴏᴏᴏ/ и при НС /ххххх/.

Анализ эритроцитов по коэффициентам, характеризующим форму показал, что форма эритроцитов закономерно изменяется: с уменьшением диаметра наблюдается увеличение прогиба центральной части клеток, характеризующейся коэффициентом Кϕ, изменяется форма периферической части, которая оценивается по коэффициенту Кэл. и происходит сдвиг к центру клетки точки, в которой толщина эритроцита максимальна, уменьшается отношение С/R. При уменьшении диаметров эритроцитов от 9,40 мкм до 6,75 мкм величина, Кϕ увеличивается от 0,14 до 0,35, величина Кэл. увеличивается от 0,6 до 1,7, а отношение С/R уменьшается от 0,72 до 0,55 (Рис.5,А,Б,В)

Масса и концентрация гемоглобина в эритроцитах также изменяется в зависимости от диаметров эритроцитов и имеет одну и ту же закономерность как для нормы, так и для НС: с уменьшением диаметров эритроцитов наблюдается уменьшение их массы и увеличение концентрации гемоглобина в клетках (Рис. 5, Г, Д).

Рис. 5. А,Б,В – Зависимость параметров формы (Кэл, Кϕ, С/R); Г, Д – массы (m) и концентрации гемоглобина (Cv) от диаметров (радиусов) эритроцитов (D, R ) в норме (++++++) и при наследственном сфероцитозе (........) Пояснения в тексте.

Теоретический анализ количественных экспериментальных данных показал, что изменения площади поверхности, объема, массы и концентрации гемоглобина, наблюдаемые при уменьшении диаметров эритроцитов по-видимому, могут быт., объяснены с помощью учета последствий отщепления от поверхности эритроцитов микропузырьков определенного размера. С помощью расчётов установлено, что для изменения площади поверхности, объема, массы гемоглобина и его концентрации в эритроците со средними параметрами в норме до состояния со средними параметрами при наследственном сфероцитозе потребуется порядка 20 отщеплений микропузырьков со средним радиусом Rj =0,34 мкм. При этом сохраняются все количественные соотношения параметров эритроцитов, полученные в эксперименте. Теоретический анализ показал, что в отщепляющихся микропузырьках может находиться гемоглобин в концентрациях, меньших, чем в исходной клетке, при этом после каждого отщепления объемная концентрация гемоглобина ( Cv в %) в эритроците возрастает.

Сравнение результатов анализа эритроцитов методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии с литературными данными показало, что величина среднего диаметра эритроцитов (8,20 мкм) соответствует данным, полученным при измерениях эритроцитов в плазме. Измеренные новым методом средние величины площади поверхности и объема эритроцитов несколько ниже данных, имеющихся в литературе. Это объясняется тем, что при измерениях площади поверхности и объема эритроцитов традиционными методами не учитываются особенности формы эритроцита, а их форма экстраполируется в общем случае к форме цилиндра (Тодоров И., 1961, Мосягина Е.Н., 1969). Данные о средних величинах массы и концентрации гемоглобина в эритроцитах хорошо согласуются с результатами, полученными при измерениях этих параметров другими методами (Козинец Г.И., соавт., 1978).

Имеющиеся в литературе сведения о полимодальной структуре распределения эритроцитов человека по диаметру в норме (Вергунова 3.И., 1979), подтверждены в данной работе для эритроцитов в норме и патологии.

Количественная оценка изменений формы, площади поверхности эритроцитов, массы и концентрации гемоглобина в клетках дополняет имеющиеся в литературе сообщения об изменениях, происходящих с эритроцитами в процессе старения. Показано, что при старении эритроцитов наблюдается уменьшение его диаметра (Бриллиант М.Д. ‚1979), изменение формы клеток (Gonsoni е.a.,1976), возрастание концентрации гемоглобина (Seaman е.а., 1977).

Известные данные о решающей роли фрагментации поверхности эритроцита в процессах старения (Рябов б.И., 1971) дают основания для проведения теоретического анализа влияния процесса отщепления микропузырьков от поверхности эритроцитов на изменение его свойств. Результаты теоретических расчётов согласуются с экспериментальными данными, что может служить еще одним подтверждением в пользу представлений о роли фрагментации поверхности эритроцитов в процессе их жизнедеятельности. Результаты исследований, проведенных методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии, хорошо согласуются с современными представлениями об эритроците, что служит доказательством достоверности результатов. Данные о наличии общих свойств эритроцитов для нормы и патологии указывают на существование единого механизма, под действием которого происходит изменение эритроцитов при различных условиях их жизнедеятельности.

Результаты исследований, проведенных методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии, хорошо согласуются с современными представлениями об эритроците, что служит доказательством достоверности результатов. Данные о наличии общих свойств эритроцитов для нормы и патологии указывают на существование данного механизма, под действием которого происходит изменение эритроцитов при различных условиях их жизнедеятельности.

3. Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов in vitro

В этой серии экспериментов исследовались эритроциты в норме и эритроциты детей больных наследственным микросфероцитозом (НС). Для облегчения расчётов и единообразия получения результатов анализ эритроцитов, помещенных в аутоплазму, проводился при условиях, когда клетки находились в виде "монетных столбиков", при этом истинных микросфер при НС не наблюдалось.

Рис. 6. Кинограмма интерференционных картин эритроцитов в отраженном лазерном свете. Время между кадрами 1 сек. (Движение внутри эритроцитов наблюдается по смещению интерференционных полос).

При разведении аутоплазмы изотоническим раствором NaCl в соотношении 1:1 и 1:5 в условиях изотонии как в норме, так и при НС, наблюдался распад "монетных столбиков" на отдельные клетки нормальной формы (двояковогнутый диск). Дальнейшее разведение аутоплазмы 0,9% раствором NaCl (1:2 и 1:8) приводило к появлению эритроцитов с выступами по краям и отдельными неровностями на поверхности. При разведении аутоплазмы (1:1О и более) происходило увеличение неоднородности поверхности эритроцитов, изменение их формы до эллипсоидальной и далее осуществлялся переход эритроцитов в сферическую форму. С помощью микрокиносъемки в отраженном лазерном свете было показано наличие интенсивного внутриклеточного движения в эритроцитах, находящихся в переходном от диска к сфере состоянии. (Рис. 6). Анализ размеров исходной формы двояковогнутого диска и конечной (сферической) показал, что изменение формы клеток сопровождается уменьшением их диаметра и площади поверхности в норме и при НС (Р<0,01), а объем при этом достоверно не изменяется.

Уменьшение общей площади поверхности эритроцитов, отмечаемое по данным интерферометрии, объясняется, по-видимому, тем, что сферуляция сопровождается образованием микровыростов, малые размеры которых не могут быть количественно учтены данным методом. Нами наблюдалось два типа сфероцитов: шиповидные с выростами на поверхности и игольчатые, с исчерченной поверхностью, без выростов.

Первый тип отмечался в основном у эритроцитов крови здоровых детей, второй у эритроцитов больных НС. Было показано, что процесс перехода от диска к сфере обратим: при переносе эритроцитов сферической формы в аутоплазму они восстанавливают свою форму до двояковогнутого диска, что подтверждается данными сканирующей электронной микроскопии (Denhcke, 1968, Weed Besis, 1973).

Для проведения сравнительной характеристики эритроцитов в норме и при НС по признаку сферуляции было выбрано два основных разведения плазмы (1:5 и 1:1О), при которых проводился анализ распределения эритроцитов в зависимости от их формы (таблица 2).

Таблица 2. Процентное распределение эритроцитов в зависимости от их формы при двух разведениях плазмы изотоническим раствором (1:5 и 1:1О) в норме и при наследственном сфероцитозе ( НС)

Сравнение полученных данных показало, что эритроциты больных НС переходят от формы двояковогнутого диска к сфере при меньших разведениях аутоплазмы изотоническим раствором NaCl по сравнению с нормой.

Переход эритроцитов в сферическую форму наблюдался также при механическом воздействии на клетку, так же при добавлении гетерогенной сыворотки. Эритроциты, выделенные из селезенки сразу после ее удаления по поводу НС, также имели сферическую форму.

Второй тип изменений формы эритроцитов имел место при разведении взвеси эритроцитов изотоническим раствором глюкозы. При этом наблюдалось общее искажение формы эритроцита, образование утолщения по краям, нарушение симметрии формы эритроцитов.

Третья группа изменений формы эритроцитов имела место при анализе клеток, предварительно подвергшихся аутогемолизу ( t =37 градусов по С) , 5-6 часов).Эритроциты при разведении аутоплазмы изотоническим раствором NaCl исследовались в микроскопе с лазерным освещением. Клетки имели искаженную поверхность, на которой постепенно

выбухали микропузырьки. Они некоторое время сохраняли связь с эритроцитами в виде жгутиков, а затем полностью отделялись от клеток.

Полученные данные можно представить в виде схемы (Рис. 7), в которой показаны три пути изменения размеров и формы эритроцитов. Причем, если первый и третий пути являются в принципе обратимыми, то второй путь необратим, вследствие потери части поверхности клетки в виде микропузырьков.

Рис. 7. Основные типы изменений формы и размеров эритроцитов. (Пояснение в тексте.)

Исследованные типы изменений формы эритроцитов хорошо согласуются с классификацией, предложенной на основе анализа клеток по данным электронной микроскопии (Козинец Г.И., соавт., 1979) но по данным голографической интерферометрии и лазерной микроскопии размеры эритроцитов значительно отличаются от результатов, полученных методом растровой электронной микроскопии, так как при обработке эритроциты уменьшаются в размерах (Крымский Л.Д. ‚соавт., 1976).

Исследование новыми методами динамики перехода формы эритроцита от диска к сфере и явления отщепления микропузырьков от поверхности клеток представляет значительный интерес, так как по современным данным эти явления лежат в основе того многообразия форм и типов эритроцитов, наблюдаемых с помощью электронномикроскопических методов в норме и патологии. Показано, что сферуляция эритроцитов может происходить in vitro как при действии различных веществ ( La Selle e. а. ,1980), так и пря взаимодействии с макрофагами ( Guerry е.а. , 1967). Длительное хранение эритроцитов также в конечном итоге приводит к изменению формы эритроцитов до сферической (Крымский Л.Д., соавт., 1976). Сфероциты отмечаются при различного рода анемиях и других заболеваниях, приводящих к нарушению свойств эритроцитов (Идельсон Л.И., 1979). Таким образом, явление сферуляции, наблюдаемое как in vivo так in vitro является единым ответом клетки на разнородные воздействующие факторы. С другой стороны, показано, что нормальная селезенка, задерживает сфероциты независимо от того, врожденное это или искусственно созданное изменение эритроцитов (Канаев С.В., Тушинская М.М., 1979/. В связи с вышеизложенным представляет интерес тот факт, что эритроциты при НС хотя и не имеют форму сферы, однако переход от диска к сфере при данном заболевании происходит при более слабых воздействиях по сравнению с нормой.

Результаты работы показали, что такие сложные процессы как явление сферуляции эритроцитов и отщепление микропузырьков от поверхности могут быть прослежены в динамике методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии. Оценка этих сложных явлений новыми методами углубляет представления о процессах жизнедеятельности эритроцитов периферической крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Количественная оценка состояния эритроцитов в норме и патологии, проведенная методами голографической интерферометрии и лазерной микроскопии в проходящем и отраженном свете показана эффективность использования данных методов для анализа эритроцитов, позволило в количественном виде выразить общие закономерности изменения размеров и формы эритроцитов, массы гемоглобина и его концентрации в клетках вне зависимости от патологии. Применением новых методов с использованием микрокиносъемки и видеозаписи позволило на нефиксированных клетках проследить основные виды преобразования формы и размеров эритроцитов образования микропузырьков на поверхности эритроцитов и перехода от диска к сфере и дать им количественную оценку.

В результате проделанной работы была разработана схема голографического интерференционного микроскопа, выявлены достоинства метода (возможность количественной оценки нефиксированных клеток), и недостатки (трудоемкость обработки данных), указаны пути улучшения прибора: введение электронного устройства съема оптической информации и ввода ее в ЭВМ). Разработаны методики интерференционного анализа эритроцитов.

Методы голографической интерферометрии и лазерной микроскопии в значительной степени дополняют традиционные микроскопические методы исследования: анализ клеток в проходящем свете, методы темного поля и фазового контраста, они обладают рядом преимуществ, расширяющих возможности оптической микроскопии. Анализ интерферограмм эритроцитов позволяет проводить количественную оценку формы клеток вводя соответствующие коэффициенты, вычислять площадь поверхности и объем эритроцитов. Одновременно можно измерять массу гемоглобина и его концентрацию. Голографический микроскоп позволяет наблюдать клетки в проходящем лазерном свете и выявлять наличие неоднородностей в клетках. Микрокиносъемка интерферограмм эритроцитов в отраженном лазерном свете позволяет следить за преобразованиями формы и поверхности клеток. Качественная и количественная оценка объектов исследования может проводится без их окраски и фиксации, что позволяет проводить анализ клеток в динамике.

ВЫВОДЫ

1. На основе отечественной аппаратуры создан оригинальный макет голографического микроскопа, который дает возможность методами интерферометрии и лазерной микроскопии проводить количественную и качественную оценку состояния эритроцитов в динамике.

2. Получены экспериментальные данные, позволяющие в количественном отношении анализировать форму эритроцитов, измерять площадь поверхности, объем клеток, массу гемоглобина и его концентрацию в эритроцитах без их окраски или фиксации, что дает возможность изучать в динамике процессы сферуляции эритроцитов и отцепление микропузырьков от поверхности эритроцитов.

3. Анализ параметров поперечного сечения эритроцитов и их интерферограмм позволил выявить следующие закономерности:

а) при уменьшении диаметра эритроцитов происходит изменение формы центральной и периферической части клеток и сдвиг максимальной толщины к центру.

6) с уменьшением диаметра эритроцитов наблюдается уменьшение площади поверхности клеток и массы гемоглобина, увеличение его объемной концентрации.

в) распределение эритроцитов в зависимости от их диаметров носит полимодальный характер с наличием пяти пиков. Эти закономерности характерны для эритроцитов как в норме, так и при патологических состояниях.

4. Не показано достоверных различий между эритроцитами в ‘норме при диффузном гломерулонефрите и сахарном диабете по измеренным параметрам. Эритроциты больных наследственным сфероцитозом в аутоплазме имеют форму утолщенных двояковогнутых дисков с уменьшенной площадью поверхности и неизменным объемом, что соответствует снижению коэффициента сферичности клеток при данном заболевании по сравнению с нормой.

5. Наблюдаемое в эксперименте изменение формы эритроцитов от дискоидальной до сферической представляет собой обратимый процесс, который сопровождается уменьшением общей площади поверхности без значительного изменения объема. Этот переход не зависит от природы действующего фактора и является специфической реакцией эритроцитов на внешние воздействия. Эритроциты при наследственном микросфероцитозе переходят в сферическую форму при меньших по сравнению с нормой воздействиях на клетки.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение гемолиза эритроцитов методам голографической интерферометрии. Гинзбург В.М., Метелкин А.Н., Степанов Б.М., Ионов Б.В., Чернух А.М. В сб. Научные труды МИРЭА – М., 1977, вып. 9, с. 146-151.

2. Метелкин А.Н. Особенности исследования геометрических свойств живых клеток методом голографической интерферометрии. В с6. Научные труды ВНИИФТРИ. М., 1976, стр. 40-46.

3. Метелкин А.Н., Ионов Б.В. Применение голографической интерферометрии для изучения биомедицинских микрообъектов. В сб.: Средства и методы квантовой электроники в медицине.

Саратов, Изд-во Саратовского ун-та, 1976, с. 193-194.

4. Метелкин А.Н. Определение размеров эритроцитов методом голографической интерферометрии. В сб.: Четвертая Енисейская биофизическая конференция "Механизмы регуляции эритропоэза". Тез. док. Красноярск, 1978, с. 141-142.

5. Метелкин А.Н., Манин В.Н., Румянцев А.Г. Анализ формы и размеров эритроцитов при наследственном сфероцитозе и у здоровых детей методом голографической интерферометрии. Педиатрия, 1980, №5, с. 4345.