Помоги проекту - поделись книгой:
Учёные провели ряд экспериментов, чтобы понять, как Ким удалось избавиться от этой неприятной болезни, и в ходе исследований наткнулись на некоторые подсказки. Мутантный ген, ответственный за состояние Ким, все ещё присутствовал в клетках, взятых из её кожи, но в клетках крови мутация по необъяснимым причинам отсутствовала. Более детально проанализировав ДНК, взятую из клеток крови Ким, учёные обнаружили нечто ещё более необычное: исследование показало, что лейкоциты женщины уже не содержат дефектный ген, хотя в других типах клеток он по-прежнему присутствует. Рассмотрев хромосомы из лейкоцитов, медики обнаружили аномалию: одна из хромосом отличалась от другой. Полное исследование генома показало, что в хромосоме произошла перестановка ряда участков, а та часть, которая включала неисправный ген и ещё 163 других, была и вовсе утрачена.
После проведения ряда исследований и тестов учёным Национального института здравоохранения США удалось получить объяснение счастливой случайности в деле Ким. Они пришли к выводу, что в одной клетке ее тела произошло необычное явление, называемое хромотрипсис, при котором хромосома внезапно разрушается и затем снова восстанавливается, что приводит к массивной перестройке генов внутри неё. Эффекты в организме обычно бывают либо тривиальными (если поврежденная клетка немедленно умирает), либо катастрофическими (если перестроенная ДНК активирует гены, вызывающие рак). В организме Ким хромотрипсис оказал другой эффект. При сборке хромосомы были утрачены некоторые гены, в данном случае – дефектные. Мутировавшая клетка не только росла нормально, но – поскольку теперь она была избавлена от больной копии CXCR4 – она освободилась от гена, вызывающего синдром WHIM. При хромотрипсисе в небольшой области генома одномоментно происходит множество перестроек. Хромосома фрагментируется, затем ее участки собираются вновь, но порядок их следования меняется, а некоторые из них и вовсе разрушаются. Если нарушений оказывается слишком много, клетка гибнет, а в более редких случаях выживает. Хромотрипсис наблюдается при раке или врожденных заболеваниях.
У женщины с WHIM-синдромом хромотрипсис произошел в стволовых клетках, из которых при дифференциации образуются лейкоциты. Затем здоровые клетки вытеснили клетки с прежним дефектным вариантом генома и обеспечили нормальную работу всей иммунной системы.
Чтобы подтвердить свою догадку, сотрудники Национального института аллергии и инфекционных заболеваний начали проводить эксперименты – они подсаживали мышам стволовые клетки трех типов. В одних клетках было две нормальных копии гена CXCR4, в других – одна нормальная, а вторая дефектная, в клетках третьего типа содержалась нормальная копия, а вторая отсутствовала вовсе.
Позже исследователи, изучавшие состояние Ким, отметили: «В своем случае Ким была бенефициаром беспрецедентного эксперимента природы, в котором одна стволовая клетка подверглась спонтанному изменению, которое избавило клетку и все её потомственные клетки от больного гена. Проще говоря, это была благословенная случайность, которая, если бы она развернулась иначе, могла убить Ким, но вместо этого спасла ей жизнь».
Чтобы лучше понять, насколько удачным был случай с вышеуказанной пациенткой, представьте, что человеческий геном – это программное обеспечение или компьютер. В случае с Ким программное обеспечение содержало одну неисправность среди примерно 6 миллиардов, которые составляли всё ПО. Чтобы устранить проблему в программе, не нужно слепо удалять большие куски кодов или заново шифровать другие части всей программы. Помимо того что данные действия почти наверняка не помогут исправить положения, скорее всего в попытках скорректировать ошибку таким способом будет внесено ещё больше новых ошибок, чреватых серьёзными последствиями. И может лишь несказанно повезти в случае, если удастся случайно удалить именно ту крошечную составляющую, которая содержит ошибку, так, чтобы не нарушить полностью всю функцию программного обеспечения.
Именно это и произошло в геноме Ким – но в роли слепого программиста в данном случае выступила сама природа. Но как бы ни был удивителен случай Ким, ещё чудеснее то, что она в истории не одна. В научной литературе есть примеры и других пациентов, которые были частично или полностью излечены от генетического заболевания в результате случайного, спонтанного «редактирования» генома.
Например, в 1990-х годах в Нью-Йорке у двух пациентов был диагностирован генетический синдром, называемый тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИД), также известный как алимфоцитоз, синдром Гланцмана – Риникера. Тяжёлый комбинированный иммунодефицит – крайне тяжёлая форма наследственного иммунодефицита, при котором в результате дефекта одного из генов нарушается работа иммунной системы. Болезнь известна также как «синдром мальчика в пузыре», потому что страдающие от этого заболевания дети крайне уязвимы перед инфекционными болезнями и вынуждены постоянно находиться в стерильной среде. Больным необходима строгая изоляция, лечение и успешная трансплантация стволовых клеток, в противном случае дети с таким иммунодефицитом обычно умирают в течение первого года жизни от тяжёлых рецидивирующих инфекций.
Тем не менее, в Нью-Йорке два пациента с данным синдромом стали исключением из этого ужасного правила: они оставались здоровыми и в подростковом, и во взрослом возрасте. Причиной в обоих случаях, как удалось выяснить учёным, стало спонтанное исправление клетками пациентов вызывающей болезнь мутации в гене под названием ADA, – гене аденозиндезамидазы, и происходило это каким-то чудесным образом, не нарушая оставшейся части гена или хромосомы.
Подобные случаи самопроизвольного естественного редактирования генов способствовали исцелению нескольких пациентов и с другими тяжелыми генетическими заболеваниями, такими, как синдром Вискотта, – Олдрича, – редкого наследственного расстройства. У больных синдромом Вискотта – Олдрича значительно повышен риск развития злокачественных опухолей и аутоиммунных нарушений. Оказалось, что в случае с данным заболеванием около 20 процентов пациентов спасаются путем спонтанной генетической коррекции. Также встречались случаи спонтанного излечения тирозинемии, – заболевания, при котором мутации гена приводят к нарушению метаболизма тирозина с повреждением печени, почек и периферических нервов. Также при некоторых кожных заболеваниях присутствие клеток с самопроизвольно изменёнными генами видно невооруженным глазом, – например, при неприятнейшем состоянии – ихтиозе, который оставляет на коже красные шелушащиеся пятна. Клетки в этих областях несут генетическую мутацию, но клетки в окружающих здоровых участках кожи, сумевших исправить мутацию, выглядят нормально.
В целом, однако, шансы спонтанно излечиться от генетического заболевания ничтожны. Большинство пациентов никогда не испытают естественного чуда, когда их геномы неожиданно сами изменятся в лучшую сторону совершенно неожиданным образом и станут правильными клетками, находящимися в нормальных тканях. Естественное редактирование генов остается аномалией – лишь интересными медицинскими случаями с участием небольшого количества пациентов, выигравших генетическую лотерею, и не более того.
Но что, если редактирование генов можно было бы превратить из спонтанного события в управляемое? Что, если бы у врачей был способ собственноручно устранить вредные мутации, которые вызывают тяжёлый комбинированный иммунодефицит, синдром Вискотта – Олдрича, WHIM или любое другое генетическое заболевание? Многих учёных такие случаи, как с Ким, наталкивали на размышления, – не только потому что раскрывали целительную силу естественного редактирования генов, но и потому, что проливали свет на потенциальный путь медицинского вмешательства в геном: способ обратить последствия генетических заболеваний путем рационального и преднамеренного исправления ошибок.
Счастливые истории чудом излечившихся пациентов показали, что преднамеренное редактирование генов было бы возможно, если бы учёные имели генетическое ноу-хау и биотехнологические инструменты для его воплощения в жизнь. В течение десятилетий, задолго до того как пионеры, открывшие технологию CRISPR, представили миру свои фундаментальные работы, большое количество специалистов трудились над тем, чтобы получить это ноу-хау и разработать эти инструменты.
Конечно же, на самом деле учёные мечтали о редактировании генов, которое будет иметь значение для медицины, ещё задолго до того как узнали, что природа предоставит им ключи для его создания. Однако, чтобы сделать такую технологию возможной, исследователям необходимо было понять сам геном: из чего он состоит, как именно он построен и, что наиболее важно, – каким образом его можно модифицировать и манипулировать им в дальнейшем. Только обладая этими базовыми знаниями стало можно сделать первые небольшие шаги к тому, чтобы обрести возможность помогать людям, которые, в отличие от Ким, были бессильны излечить себя сами.
Геном – термин, введенный в 1920 году немецким биологом Гансом Винклером, относится ко всему набору генетических инструкций, найденных внутри клетки. Проще говоря, геном – это совокупность всего наследственного материала, заключённого в клетке любого живого организма. Геном содержит биологическую информацию, необходимую для построения и поддержания организма. Большинство геномов, в том числе геном человека и всех остальных клеточных форм жизни, состоят из 23 пар хромосом и митохондриальной ДНК. В основном идентичный от клетки к клетке, за исключением случайной мутации, геном сообщает организмам всех живых существ, как расти, как поддерживать себя и передавать гены потомству. Геном одного организма направляет его на рост плавников и жабров, которые позволяют ему двигаться и дышать под водой; геном другого инструктирует его производить листья и хлорофилл, которые позволяют собирать энергию от солнечного света. Наши внутренние физические особенности – зрение, рост, цвет кожи, предрасположенность к болезням и т. д. – тоже являются результатом информации, закодированной в геноме. Генетический код – это чередование четырёх молекулярных букв, четырёх азотистых оснований в нуклеиновых кислотах, ДНК и РНК.
Геном состоит из молекулы, называемой дезоксирибонуклеиновой кислотой, или ДНК, которая построена из четырех различных блоков. ДНК – это макромолекула, которая обеспечивает хранение и передачу из поколения в поколение генетической информации для функционирования живых организмов. Молекула ДНК хранит биологическую информацию в виде генетического кода, состоящего из последовательности нуклеотидов. Нуклеотиды – это буквы ДНК: А, G, С и Т, – сокращения от химических групп (также называемых основаниями) аденина, гуанина, цитозина и тимина, которые различают четыре соединения. Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями: аденин (А) соединяется только с тимином (Т), гуанин (G) – только с цитозином (С). Буквы этих молекул связаны длинными прямыми нитями. Нити объединяются, формируя известную структуру ДНК в форме двойной спирали. Двойная спираль напоминает скрученную лестницу. Две нити ДНК сплетаются друг с другом вдоль центральной оси, вместе они образуют два боковых рельса лестницы. Такое расположение размещает четыре различных основания внутри спирали – ступеньки лестницы. Изящной особенностью структуры является набор химических взаимодействий, которые удерживают две нити вместе на каждой ступени, что-то вроде молекулярного клея: буква А одной нити всегда соединяется с Т на другой нити, a G всегда соединяется с С. Они известны как спаренные основания ДНК.
ДНК была открыта двумя учёными: англичанином Фрэнсисом Криком и американцем Джеймсом Уотсоном. Это открытие произошло в Великобритании. Уотсон в то время работал в лаборатории Кембриджа и был чрезвычайно увлечён идеей открытия структуры молекулы ДНК. К тому времени уже имелись данные о том, что ДНК является носителем генетической информации, но нельзя сказать, что они были достаточно достоверными для учёных. Уотсон повстречался с Криком, увлеченным той же идеей; разделяя научные интересы, исследователи быстро нашли общий язык в поисках раскрытия структуры ДНК.
В то время молекула ДНК не была чем-то новым. О попытках вывести её уже было известно. ДНК интересовался швейцарский врач Фридрих Мишер ещё в 1869 году. Крик и Уотсон были твёрдо убеждены, что ключ к разгадке тайны генома находится именно выяснении структуры молекулы ДНК. Уотсон и Крик обобщили все имеющиеся у них данные и создали трёхмерную модель молекулы ДНК из куска картона, проволоки и шариков. Учёные выяснили, каким образом происходит репликация, т. е. удвоение ДНК в клетках: ДНК разделялась пополам, открепляясь в местах водородных связей, и новая ДНК синтезировалась из половины основной. Другими словами, из половины прежней молекулы образовывалась новая целая молекула ДНК. Это открытие стало одним из самых выдающихся научных событий века.
Как уже упоминалось выше, роль ДНК состоит в обеспечении и воспроизведении жизни, – в нуклеотидах ДНК хранится и передаётся наследственная информация.
В годы, последовавшие за открытием Уотсона и Крика, учёные пытались понять, как структура этой молекулы и довольно простые химические ингредиенты могут кодировать информацию и объяснять явления биологической жизни. Оказывается, ДНК очень похожа на секретный язык, каждая конкретная последовательность букв содержит инструкции для производства определенного белка внутри клетки. Затем эти белки выполняют большинство решающих функций в организме, таких как расщепление пищи, распознавание и уничтожение патогенных микроорганизмов и восприятие света.
Чтобы преобразовать инструкции, содержащиеся в ДНК, в белки, клетки используют важную промежуточную молекулу, называемую рибонуклеиновая кислота, или РНК. РНК – одна из трёх основных макромолекул, содержащихся в клетках всех живых организмов (две другие макромолекулы – это ДНК и белки). Так же, как ДНК, РНК состоит из длинной цепи, в которой каждое звено называется нуклеотидом. Последовательность нуклеотидов позволяет РНК кодировать генетическую информацию. Все клеточные организмы используют РНК для программирования синтеза белков. Клеточные РНК образуются в ходе процесса, называемого транскрипцией, то есть синтеза РНК на матрице ДНК.
Гены и белковые продукты отличаются друг от друга последовательностью нуклеотидов в генах и аминокислот в белках. Этот общий поток генетической информации – от ДНК к РНК к белку – является языком, используемым для сообщения и выражения жизни.
Размер генома и количество содержащихся в нём генов широко варьируется в разных царствах живых существ. Например, у большинства вирусов всего несколько тысяч букв ДНК (или РНК, поскольку некоторые вирусные геномы не содержат ДНК) и небольшое количество генов. Бактериальные геномы, напротив, состоят из миллионов букв и содержат около 4000 генов. Другие же геномы имеют около 14000 генов, распределенных по сотням миллионов пар оснований ДНК. Геном человека – это целая энциклопедия, содержащая 21 000 кодирующих белок генов, написанная четырьмя буквами. Интересно, что размер генома не является показателем сложности организма: человеческий геном примерно такой же длины, что и геном мыши или лягушки, примерно в десять раз меньше генома саламандры и более чем в сто раз меньше генома некоторыхрастений.
Геномы различных живых существ выстроены совершенно по-разному. В то время как геномы большинства бактерий находятся внутри клетки и представляют собой одну продолжающуюся часть ДНК, геном человека состоит из 23 отдельных частей, называемых хромосомами, длиной от 50 до 250 миллионов букв. Как и клетки почти всех млекопитающих, человеческие обычно содержат две копии каждой хромосомы, одну от отца, одну от матери. Каждый родитель вносит 23 хромосомы, что дает потомку в общей сложности 46. Есть и исключения из этого правила, – например, у людей с синдромом Дауна есть третья копия хромосомы 21. Полный набор ядерных хромосом можно найти почти в каждой клетке организма (эритроциты являются важным исключением, поскольку у них нет ядра), но ядро – не единственное место в клетке, где обнаружена ДНК. Геном человека также включает в себя отдельную мини-хромосому – всего 16 тысяч букв ДНК, расположенных в митохондриях, – энергетических батареях клетки. В отличие от генетического кода, обнаруженного в других хромосомах, митохондриальная ДНК наследуется исключительно от матери.
Мутации в любой из 23 ядерных хромосомных пар или в хромосоме митохондрии могут вызывать генетические заболевания. Самая простая мутация – это замена. Замена одного нуклеотида другим может нарушить состав гена и вызвать образование дефектного белка. Например, при серповидноклеточной анемии, генетическом заболевании крови, 17-я буква гена, известного как бета-глобин, видоизменяется, или мутирует из А в Т. Эта мутация приводит к изменениям в транспорте кислорода в эритроцитах. Последствия этого крошечного изменения в белке – разница всего в 10 атомов – ужасны. Молекулы мутированного гемоглобина слипаются и образуют аномальные нити, которые изменяют форму эритроцитов, что приводит к анемии, повышенному риску инсульта и развития инфекций, а также сильным болям в костях. Серповидноклеточная анемия связана с мутацией гена НВВ, стимулирующего производство аномального гемоглобина S, в молекуле которого вместо глутаминовой кислоты в шестом положении β-цепи находится валин. В условиях гипоксии гемоглобин S полимеризуется, и эритроциты приобретают серповидную форму. Спектр симптомов серповидноклеточной анемии чрезвычайно широк, от повышенной утомляемости и отёчности до образования язв на ногах, закупорки сосудов в печени и селезёнке и слепоты, подверженности инфекциям, задержек в развитии. Серповидноклеточная анемия является примером рецессивного генетического заболевания. Это означает, что обе копии гена НВВ человека должны нести мутацию, чтобы человек страдал от серповидноклеточной анемии; если мутация же только в одной копии гена, то немутировавший ген может продуцировать достаточно нормального гемоглобина, чтобы преодолеть негативные эффекты мутировавшего. Однако люди с одной мутантной копией гена НВВ по-прежнему останутся носителями признаков серповидноклеточной анемии, и несмотря на то, что болеть они не будут, они всё же сохранят способность передавать мутировавший ген потомству.
Другие генетические заболевания предполагают доминантное наследование, а это означает, что для того, чтобы вызвать заболевание, достаточно лишь одной копии мутировавшего гена. Одним из примеров является упомянутый ранее WHIM-синдром, при котором одна тысячная буква гена CXCR4 видоизменяется из С в Т; мутантный ген создает гиперактивный белок, который доминирует в функционировании здорового гена.
Серповидноклеточная анемия и WHIM-синдром являются примерами генетических заболеваний, вызванных простыми мутациями замещения (ошибочная замена одной буквы ДНК на другую). Но генетические заболевания также могут быть и результатом вставок в ДНК и удаления компонентов из ДНК. Например, нейродегенеративное расстройство, известное как хорея Генгтинтона, развивается вследствие мутации гена НТТ на 4-й хромосоме, вызывающей патологическое увеличение в молекуле ДНК числа копий, кодирующих аминокислоту глутамин. В результате этого на основе гена синтезируется крупный белок гентингтин, имеющий в своем составе удлиненную цепочку из глутаминовых остатков, накапливающихся внутри нейронов и приводящих к развитию заболевания, патогенез которого окончательно не известен. Чем больше содержится копий, тем раньше дебютирует заболевание и сильнее выражены его симптомы. Количество этих копий может увеличиваться в последующих поколениях и тем самым приводить к более тяжелым фенотипам заболевания в семье.
И наоборот, удаления являются виновниками наиболее распространенного типа муковисцидоза – опасного для жизни генетического заболевания, которое поражает в первую очередь легкие. Муковисцидоз является системным наследственным заболеванием, обусловленноым мутацией гена, вследствие которой поражаются железы внешней секреции и возникают тяжёлые нарушения работы органов дыхания. В основе заболевания лежит мутация в гене CFTR, который локализован в середине 7-й хромососы. Удаление трех букв генетического кода в гене CFTR приводит к тому, что белок лишается важной аминокислоты и поэтому не функционирует должным образом.
Другие заболевания возникают, когда сегменты гена инвертированы (то есть расположены в обратном порядке) или когда сегменты или даже целые хромосомы ошибочно дублируются или удаляются.
Мы знаем генетические причины многих заболеваний благодаря относительно недавнему появлению секвенирования ДНК, – процесса, который позволяет учёным читать и записывать содержание человеческого генома буква за буквой. Секвенирование – это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. После того как первые методы секвенирования были разработаны (в 1970-х годах), учёные начали кропотливо искать коренные генетические причины самых известных наследственных заболеваний.
Огромный скачок был сделан в этой области после завершения международного проекта «Геном человека» в 1990 году. Его целью было определить полную последовательность нуклеотидов в человеческом геноме. Основной объём работ выполнялся в университетах и исследовательских центрах США, Канады и Великобритании. Этому масштабному начинанию способствовали новая технология, которая позволила клонировать большие куски человеческой ДНК, а также значительные улучшения в лабораторных исследованиях и разработка сложных вычислительных алгоритмов, которые помогли проанализировать данные секвенирования. В 2001 году был опубликован первый вариант генома.
С момента завершения проекта «Геном человека» процесс секвенирования ДНК и целого генома стал быстрым, дешевым и эффективным. Учёные точно определили более четырех тысяч различных видов мутаций ДНК, которые могли вызвать генетические заболевания. Секвенирование ДНК может сообщить людям о том, имеют ли они повышенный риск развития определенных видов рака, а это в свою очередь может помочь адаптировать специфические методы лечения так, чтобы они наилучшим образом соответствовали генетическим особенностям разных пациентов. Кроме того, теперь, когда коммерческий анализ последовательности ДНК стал общепринятым и стоит не слишком дорого, миллионы людей решили проанализировать свои собственные геномы, что легко можно сделать просто отправив образец слюны в лабораторию по почте. Полученный в результате усилий учёных объём данных помог выявить важные связи между тысячами вариантов генов и рядом физических и поведенческих особенностей.
Тем не менее, хотя секвенирование генома представляет собой огромный прогресс в изучении генетических заболеваний, оно в конечном итоге является диагностическим инструментом, а не формой лечения. Секвенирование позволило учёным увидеть, как генетические заболевания пишутся на языке ДНК, но не дало возможности вторгаться в этот язык и менять его для пользы человечества; научиться читать на новом языке и научиться писать на нём – совершенно разные вещи. Учёным был необходим новый набор инструментов.
Исследователи мечтали о лечении болезней, связанных с мутациями в ДНК, с тех пор, как узнали о существовании этих генетических заболеваний. Несмотря на то что одни учёные начали определять первопричины генетических нарушений, другие настойчиво искали новые методы лечения этих заболеваний – не просто предоставляя пациентам лекарства для временного смягчения неблагоприятных воздействий мутировавшего гена, но и для восстановления самих генов, чтобы навсегда переломить течение болезни. Возьмём лишь один, к сожалению, общий пример: серповидноклеточную анемию часто лечат переливанием крови, медикаментами и трансплантацией костного мозга. Не лучшим ли решением было бы нацелиться на мутацию самой причинной ДНК так, чтобы исправить её?
Учёные в ту пору исследований ДНК знали, что лучшим решением для лечения генетических заболеваний стало бы исправление самого гена с дефектом, иными словами, мечтали научиться преднамеренно делать то, что природа сделала случайно, когда вылечила упомянутую Ким и других счастливчиков. Однако же для ученых того времени сама идея излечения генетических заболеваний путем переписывания мутировавшего генетического кода казалась просто невозможной к воплощению в реальность. Исправление дефектного гена было бы похоже на поиск иголки в стоге сена и последующее извлечение этой иголки, причём не нарушая целостности всего стога. Тем не менее исследователи подозревали, что могут сотворить нечто подобное путём добавления генов-заместителей в поврежденные клетки. Вопрос был в том, каким же путём внедрить этот драгоценный материал в поражённый участок.
Вдохновлённые удивительной способностью вирусов встраивать новую генетическую информацию в ДНК бактериальных клеток, пионеры этой ранней генной эпохи поняли, что, возможно, таким путём они могут использовать вирусы для доставки нужных генов в организм человека.
Первые зарегистрированные попытки сделать это были предприняты в конце 1960-х годов Стэнфилдом Роджерсом, американским врачом, который изучал вирус, вызывающий образование бородавок у кроликов, – вирус папилломы Шоупа. Роджерс особенно интересовался одним аспектом вируса Шоупа: вирус заставлял кроликов производить в избыточном количестве аргиназу, фермент, который организм кроликов использовал для нейтрализации аргинина, вредной аминокислоты. В организмах больных кроликов было намного больше аргиназы и намного меньше аргинина, чем у здоровых кроликов. Более того, Роджерс обнаружил, что у исследователей, которые работали с вирусом, уровень аргинина в крови был ниже нормы. По-видимому, эти учёные заразились вирусом от кроликов.
Роджерс подозревал, что вирус Шоупа отправляет ген в клетку, чтобы повысить продукцию аргиназы. Он был поражён способности вируса передавать генетическую информацию настолько эффективно, и задался вопросом, может ли сгенерированная копия передавать другие, полезные гены для получения интересующих исследователей результатов. Через много лет Роджерс вспоминал: «Тогда стало ясно, что в процессе изучения болезни открыт новый терапевтический метод».
Роджерсу не пришлось долго ждать появления болезни, которая дала бы возможность проверить его теорию. Всего несколько лет спустя у двух немецких девушек было диагностировано генетическое заболевание, характеризуемое недостаточностью аргиназы. Подобно кроликам, инфицированным вирусом папилломы Шоупа, в организмах этих двух пациенток уровень аргинина был ненормальным, но не низким, а наоборот, чрезвыйчайно повышенным. Ген, который вызывал продукцию аргиназы, – тот самый ген, который, как подозревал Роджерс, передавался с вирусом Шоупа, вовсе отсутствовал либо мутировал.
Роджерс знал, что раннее вмешательство в болезнь, особенно в случае младшей из двух немецких пациенток, может предотвратить худшие из последствий болезни. Также Роджерс знал, что многие вирусы при инфицировании клетки не вредят ей, именно таким был вирус папилломы Шоупа. Это обстоятельство позволило использовать его для попытки лечения девушек. Тогда Роджерс вместе со своими немецкими коллегами решил ввести огромные дозы очищенного вируса Шоупа прямо в кровоток пациенток.
К сожалению, экспериментальная генная терапия не увенчалась успехом. Инъекции оказали небольшое влияние на девушек, а самого Роджерса широко осуждали за процедуру использования данных инъекций, которую многие учёные считали безрассудной и преждевременной.
Возможность использования собственной информации вирусов были показана Роджерсом на примере вируса папилломы Шоупа, который несет в своем геноме информацию для синтеза специфического энзима – аргиназы и, несмотря на то, что Роджерс никогда больше не пытался проводить генную терапию снова, его попытка использования вирусов в качестве переносчиков генов произвела революцию в области биологии. Эксперимент не удался, но сам его факт оказался полезным для науки, и на сегодняшний день использование вирусов является одним из наиболее эффективных способов введения генов в геном клетки и, таким образом, даёт возможность изменить генетический код живых организмов.
Несколько специфических признаков делают вирусы эффективными в качестве переносчиков генетического материала в клетки. Они обладают исключительной способностью проникать в клетки любого типа. Пока существует жизнь, организмам всех царств – бактерий, растений, животных – приходится бороться с вирусами-паразитами, единственная цель которых захватить клетки, вставить в них свою собственную ДНК и обмануть клетки путём создания всё большего количества своих копий внутри. Вирусы научились использовать практически каждое уязвимое место в защитной системе клетки, чтобы внедриться и захватить её. Вирусы усовершенствовали стратегии вброса своей генетической информации внутрь клетки. В качестве инструмента для внедрения новой информации в клетку вирусные частицы поразительно надежны; исследователи, работающие с вирусами, могут вводить гены в клетки-мишени с эффективностью почти 100 процентов. Таким образом, для первопроходцев, использовавших вирусы в терапевтических целях, они были палочкой-выручалочкой, своеобразными троянскими конями.
Вирусы настолько умны и хитры, что знают не только как внедрить свою ДНК внутрь клетки чужеродного организма, но также как заставить новый генетический код удерживаться в этой клетке. В 1920-1930-х годах, в первые годы генетических исследований, сфокусированных на бактериях, учёные были озадачены уникальной способностью вирусов появляться, казалось бы, ниоткуда и вызывать инфекции. Последующие исследования продемонстрировали, что эти вирусы способны расщеплять свой геном в бактериальную хромосому и оставаться необнаруженными до тех пор, пока условия не станут подходящими, чтобы они могли начать развитие активной агрессивной инфекции.
Ретровирусы, большой класс, который включает вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), делают то же самое с людьми, встраивая свой генетический материал в геном инфицированных клеток, поэтому уничтожить ретровирусы очень сложно.
Генная терапия представляет собой лечение наследственных и приобретенных заболеваний путем введения в соматические клетки пациента генетических элементов для восстановления или подавления функций генов и придания клеткам заданных свойств. После первых попыток генной терапии в 1960-х годах эта область совершила скачок вперёд благодаря революции с использованием рекомбинантной ДНК – универсального термина для генетического кода, созданного в лаборатории, а не природой. Используя новые инструменты биотехнологии и новые биохимические методы, учёные в 1970-1980-х годах разработали способы вырезки и вставки сегментов ДНК в геном и научились изолировать определенные последовательности генов. Это позволило вставлять т. н. терапевтические гены в вирусы, а также удалять опасные гены для того, чтобы вирусы, внедряясь в клетки, больше не наносили им вред. Иными словами, исследователи превратили эти вирусы в своеобразные полезные лифты для доставки полезной генетической информации к желаемой цели.
К концу 1980-х годов, после того как переоснащённые ретровирусы были успешно использованы для введения лабораторно созданных генов мышам, началось тестирование генной терапии в клинических условиях. Френч Андерсон и его коллеги из Национального института здоровья первыми дошли до финиша. Они разработали многообещающий переносчик информации, дополненный здоровой копией гена аденозиндеаминазы, гена, который мутирует у пациентов, страдающих от тяжелого комбинированного иммунодефицита, – алимфоцитоза, при котором в результате дефекта одного из генов нарушается работа компонентов адаптивной иммунной системы. Их целью было использовать генную терапию для постоянной интеграции немутантного гена ADA в клетки крови пациентов с иммунодефицитом, что позволило бы производить недостающий белок – шаг, который, как надеялся Андерсон и его коллеги, излечит болезнь. К сожалению, результаты этого новаторского клинического испытания оказались неутешительными; переоснащённый вирус не нанес вреда реципиентам, но оценить его эффективность не представлялось возможным.
Однако с того раннего эксперимента, проведённого десятилетия назад, в генной терапии были достигнуты феноменальные успехи. Улучшения в конструкции вирусных переносчиков информации и в методах, используемых для их внедрения, привели к чрезвычайно обнадеживающим результатам генной терапиии тяжёлого иммунодефицита у десятков пациентов, страдающих данным заболеванием. Более того, Европейская комиссия одобрила препарат Strimvelis, который представляет собой первую генную терапию для детей, предназначенную для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита.
Strimvelis – это генная терапия, которая создается для каждого конкретного пациента на основе его собственных клеток. Принцип такой терапии заключается в том, что в ДНК предварительно удаленных пораженных стволовых клеток костного мозга пациента внедряют нормальную копию гена аденозиндезаминазы. Затем исправленные клетки вводят обратно в организм. Чтобы генетически модифицированные клетки лучше прижились, перед процедурой пациент проходит низкодозовую химиотерапию.
Помимо этого, к 2016 году было проведено более 2 тысяч испытаний генной терапии различных болезней. В результате удалось расширить диапазон заболеваний, которые стало возможно лечить данными способом. С этого времени генная терапия позволяет корректировать такие наследственные заболевания, как муковисцидоз, мышечная дистрофия Дюшенна, гемофилия, некоторые формы слепоты и растущее число сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний.
Между тем область иммунотерапии рака, где борющиеся с опухолью клетки оснащаются генами, нацеленными на молекулы, специфичные для опухолей, была названа одним из наиболее многообещающих достижений в лечении онкологии.
Но несмотря на ажиотаж генная терапия не стала панацеей, на которую так надеялись врачи и учёные; порой кажется, что она принесла больше вреда, чем пользы. Область генной терапии претерпела встряску в 1999 году, когда пациент умер после перенесенного массивного иммунного ответа на высокую дозу введённых вирусных переносчиков. Затем, в начале 2000-х годов, у пятерых пациентов в ходе испытаний генной терапии для лечения иммунодефицита развился лейкоз. Рак возник в результате случайной активации ретровирусом онкогена – гена, который заставил клетки бесконтрольно размножаться. Этот случай подчеркнул риски, связанные с внедрением в клетки пациентов большого количества чужеродного агента и случайного внедрения нескольких тысяч букв ДНК в их геномы. Безусловно, эта серия клинических исследований была столь же захватывающей, как и слишком рискованной и отчаянной.
Генная терапия по самой своей природе неэффективна для широкого спектра генетических состояний, причиной которых не является отсутствие или недостаток генов. Такие ситуации не могут быть исправлены путем добавления новых генов в клетки. Возьмём к примеру хорею Гентингтона, при которой измененный ген производит аномальный белок, полностью перекрывающий действие второй, здоровой копии гена. Поскольку мутировавший ген доминирует над немутантным, простая генная терапия – добавление ещё одной нормальной копии гена с использованием переоснащённого вируса – не будет влиять на болезнь Гентингтона. Для этой и многих других трудно поддающихся лечению генетических заболеваний необходимо найти способ восстанавливать дефективные гены, а не просто вытеснять их. Если бы учёные могли исправить дефективный код, вызвавший проблему, то они смогли бы нацелиться на доминантные заболевания, не заботясь о последствиях сращивания гена в неправильном месте.
Достижение такой возможности заинтриговало учёных. В начале 1990-х годов Дженнифер Дудна и Брюс Салленгер не раз обсуждали это в лаборатории Университета Колорадо. Одной из идей, которой они увлеклись, была мысль о том, что молекулы РНК, эти посредники между ДНК и белками в клетках, могут быть изменены таким образом, чтобы исправлять мутации, которые переносят из ДНК. Учёные также обсуждали возможность редактирования исходного кода таких дефектных РНК.
В 1980-х годах, когда одни исследователи совершенствовали генную терапию, основанную на вирусах-переносчиках генного материала, другие искали более простые методы трансформации клеток млекопитающих с использованием ДНК, изготовленной в лабораторных условиях. Эти базовые методы были предназначены в основном для исследований, но по прошествии десятилетий учёные начали изучать их терапевтический потенциал в клетках человеческого организма.
Эти подходы обладали некоторыми ключевыми преимуществами по сравнению с более сложными методами переноса генов. Во-первых, они действовали намного быстрее; вместо того чтобы заниматься сложным процессом перемещения нужных генов в реконструированные вирусы, учёные могли вводить созданную в лабораторных условиях ДНК непосредственно в клетки живого организма или позволить клеткам поглощать эту ДНК, поместив клетки в специально приготовленную смесь из ДНК и фосфата кальция. Во-вторых, эти более простые методы были прямо противоположны сложной технике расщепления вируса для проникновения в клетку – клетка сама могла объединять чужеродную ДНК со своей собственной, хотя на то время и не совсем эффективно.
Мыши были первыми подопытными животными при тестировании этих методов внедрения новой генетической информации, и учёные в свою очередь поразились тому, насколько эффективными оказались новые методы при применении их на крошечных существах. Внедрив новую ДНК в оплодотворенные яйцеклетки мышей, а затем имплантировав эти яйца самкам, исследователи обнаружили, что могут постоянно передавать чужеродную ДНК следующему поколению и вызывать наблюдаемые изменения у развивающихся животных. Эти достижения означали, что любой ген, выделенный и клонированный в лаборатории, можно было проверить, исследовать и проводить эксперименты над ним; добавляя ген в клетки, учёные наблюдали эффекты и лучше понимали функцию гена.
Как именно ДНК попадала в геном? Марио Капекки, профессор Университета в штате Юта, занялся этим вопросом в начале 1980-х годов после удивительного наблюдения. Он обратил внимание на порядок следования множества копий гена, вставленных в геном. Капекки обнаружил: вместо того чтобы копии генов беспорядочно распределялись по хромосомам, они всегда группировались в одной или нескольких областях, причем многие копии накладывались друг на друга, как будто намеренно.
Капекки наблюдал эффекты процесса, называемого гомологичной рекомбинацией – хорошо известного к тому времени явления, но не того, который учёный ожидал увидеть в этом эксперименте. Гомологичная рекомбинация представляет собой тип генетической рекомбинации, при которой происходит обмен нуклеотидными последовательностями между двумя похожими или идентичными хромосомами. Это широко используемый клетками способ устранения повреждений ДНК. В наиболее известном варианте гомологичная рекомбинация происходит во время образования яйцеклеток и сперматозоидов, когда два набора хромосом, которые мы наследуем от родителей, сводятся к одному, чтобы объединиться со вторым набором. Клетки выбирают смесь отцовской и материнской хромосом; несмотря на ошеломляющую сложность смешивания, сопоставления и повторной сборки миллионов букв ДНК, клетки могут сделать это безупречно, используя гомологичную рекомбинацию. Этот же процесс происходит во всех царствах жизни; бактерии, например, обмениваются генетической информацией посредством гомологичной рекомбинации, а биологи годами используют гомологичную рекомбинацию для проведения генетических экспериментов на дрожжах.
Впоследствии Капекки построил на основе гомологичной рекомбинации генетический таргетинг – процесс, при котором в геном организма вносятся искусственные изменения. За развитие этой технологии Марио Капекки и ряд других учёных, среди них Мартин Эванс и Оливер Смитис, были удостоены в 2007 году Нобелевской премии по физиологии и медицине.
К осознанию пользы этой технологии учёные окончательно пришли спустя всего три года после исследования Капекки. Возможность целенаправленно вставлять информацию в гены стала реальностью благодаря статье, опубликованной Оливером Смитисом и его коллегами. Работая с клетками человека, полученными из опухоли, учёные намеревались заменить копии клеток гена бета-глобин искусственной рекомбинантной версией, созданной в лаборатории. Невероятно, но сработало! Это не потребовало от учёных причудливых уловок, они смешали нужную ДНК с фосфатом кальция и впрыснули ее в клетки – несколько клеток приняли чужеродную ДНК; затем соединили последовательности ДНК, встроенные в лаборатории, с соответствующими им последовательностями ДНК в геноме, и произвели некоторые молекулярные перестановки с заменой старого материала новым.
Клетки, казалось, могли сделать большую часть тяжелой работы по модификации их геномов самостоятельно. Это означало, что учёные могли привносить гены в клетки более аккуратным путём, без использования вирусов, чтобы внедрить новую ДНК в геном. Обманывая клетку, заставляя ее «думать», что рекомбинантная ДНК является просто дополнительной хромосомой, которую необходимо соединить с соответствующим геном, уже имеющимся в ее геноме, учёные могли обеспечить объединение новой ДНК с существующим генетическим кодом посредством гомологичной рекомбинации. Потенциал генетиченского таргетинга для исследований был обнадёживающим. Но Смитис знал, что гомологичная рекомбинация также может быть использована в терапевтических целях. Если бы учёные могли выполнять аналогичное нацеливание на гены в стволовых клетках крови пациента, страдающего серповидноклеточной анемией, мутировавший ген бета-глобина мог бы быть заменен нормальной, здоровой последовательностью составляющих. Но всё же учёные знали, что это открытие, бывшее тогда экспериментальным подходом, сможет быть когда-нибудь использовано для лечения болезней.
К концу 1980-х годов генетический таргетинг уже широко использовался для редактирования ДНК не только в культивируемых клетках мыши и человека, но даже и в самих живых мышах. Основополагающая работа в лаборатории Мартина Эванса продемонстрировала, что таргетинг генов в эмбриональные стволовые клетки мыши и затем введение этих модифицированных клеток обратно в эмбрионы мышей позволяет создавать живых мышей с конструктивными изменениями.
Однако несмотря на потрясающие возможности, которые открылись учёным, обнаружившим, что гены всё-таки возможно видоизменять, в раннюю эпоху генной инженерии первые годы были потрачены на фундаментальные исследования в области редактирования генов, нежели на практическое применение генетического таргетинга в профилактических или лечебных целях. Для генетиков, изучающих гены млекопитающих и пытающихся найти различные пути для лучшего понимания функций генов, генетический таргетинг стал настоящей находкой, технологией, которая сулила выигрыш. Но исследователи в области медицины с огромной осторожностью экспериментировали с генетическим таргетингом на людях, поскольку, несмотря на его эффективность, когда дело доходило до его использования для лечения заболеваний, гомологичная рекомбинация оставляла желать лучшего.
Возможно, самым большим недостатком была проблема негомологичной (незаконной) рекомбинации, где ДНК случайным образом интегрируется в геном, а не поступает в него чётко последовательно. Но учёные выяснили, что на деле незаконная рекомбинация преобладает над гомологичной примерно в 100 раз. Было ясно, что медицинское использование генной терапии с целью лечения в таком случае было бы крайне затруднительным. Учёные разрабатывали элегантные пути, чтобы обойти проблему в клетках, и не теряли надежду на будущее применение новой технологии в медицине. Как отметил Капекки в начале 1990-х годов: «В конечном итоге, гомологичная рекомбинация для генной терапии человека – единственный путь!» Но на то время казалось, что редактирование генов просто недостаточно хорошо изучено для применения с пользой для людей.
В начале 80-х годов, когда многие были заняты размышлениями о генетическом таргетинге в клетках человека, Джек Шостак ломал голову над процессом деления дрожжевых клеток. Профессор Гарвардской медицинской школы решил основательно углубиться в проблему генетического таргетинга и гомологичной рекомбинации. Шостак хотел конкретнее понять, как две нити ДНК из одной хромосомы могут объединяться с двумя совпадающими нитями ДНК из второй хромосомы, обмениваться информацией находясь на промежуточной стадии слияния, а затем снова разделяться, чтобы заново сформировать отдельные хромосомы, после того как клетки разделятся.
В 1983 году Шостак решил, что нашел ответ. Основываясь на результатах генетических экспериментов с дрожжами, он и аспирант Терри Орр-Уивер вместе с профессорами Родни Ротштейном и Фрэнклином Сталем опубликовали провокационную модель, в которой рассматривали путь репарации двуцепочечных разрывов и которая толковала многие интересующие учёных детали об обмене генетической информацией. К 1986 году Шостак уже переключил свои исследования на роль молекул РНК в ранней эволюции жизни. Но в исследовательских кругах и лабораториях всё ещё активно обсуждалась модель, представленная Шостаком, – модель двуцепочных разрывов, о которой звучали как положительные мнения, так и откровенный скептицизм научного сообщества. Но со временем стало ясно, что эта модель разработана на основе обширных экспериментальных данных. Механизм репарации двухцепочечных разрывов имел смысл не только для гомологичной рекомбинации, которая происходила во время образования яйцеклеток и сперматозоидов, но также и для рекомбинации, которая происходила всякий раз, когда ДНК была повреждена.
Все клетки подвергаются воздействию ДНК-повреждающих агентов, таких как рентгеновское излучение и канцерогены, но клетки чрезвычайно эффективны в восстановлении этих разрывов без потери генетической информации. Согласно модели Шостака этот процесс восстановления зависел от способности хромосом к гомологичной рекомбинации. Получалось, что любое повреждение одной хромосомы можно было исправить, просто скопировав соответствующую последовательность на вторую хромосому.
В случае, если модель двуцепочечных разрывов была верной, а выводы, сделанные из исследований дрожжей актуальны и для млекопитающих, то существовала очевидная возможность повысить эффективность редактирования генов: разрезать геном именно в том месте, где нужно внести в него изменения. Если учёным нужно было заменить дефектный ген в геноме созданной в лаборатории исправленной копией, то сначала им требовалось выяснить, как разрезать дефектный ген на части, с локальным двухцепочечным разрывом ДНК, и затем внедрить исправленную копию гена. Столкнувшись с разрывом, клетка попыталась бы восстановить повреждение путем поиска подходящей хромосомы для копирования – и в этот момент она нашла бы синтетический ген, созданный учёными. По сути, учёные таким образом просто-напросто обманули бы клетку, заставив её «думать», что она была повреждена естественным образом, после чего начала репарироваться.
Специалисты лаборатории профессора Марии Ясин, исследователя из онкологического центра имени Слоуна-Кеттеринга, стали первыми играть в эту тонкую игру, решив провести эксперименты на клетках млекопитающих в 1994 году. Остальные учёные с интересом наблюдали за новаторской работой, построенной на модели двухцепочечного разрыва. Эксперимент по редактированию генов в лаборатории Ясин был весьма изобретательным. Ее стратегия заключалась в том, чтобы ввести такой фермент в клетки мыши, который разрезал геном на части, создавая двухцепочечный разрыв; в то же время она добавляла в клетки кусочек синтетической ДНК – шаблон для восстановления – который соответствовал вырезанной последовательности ДНК. Позже она проверяла, восстановили ли клетки мыши поврежденную ДНК, подключив внедрённый шаблон. Проведя один итот же эксперимент с добавленным ферментом и без него, Ясин смогла проверить свою гипотезу: искусственно созданный двухцепочечный разрыв повышает эффективность гомологичной рекомбинации.
Задача заключалась в том, чтобы придумать такой жизнеспособный фермент, который вырезал бы геном в одном конкретном месте из миллиардов возможных. Чтобы решить эту проблему, Ясин ловко украла молекулярный кусочек у дрожжей: эндонуклеазу I-Scel. Нуклеазы – это ферменты, которые расщепляют нуклеиновые кислоты; некоторые разрезают РНК, другие ДНК.
I-Scel, которую выбрала Мария Ясин, была одной из самых специфических эндонуклеаз, известных в то время, для которой требовалось идеальное совпадение 18 последовательных букв ДНК, чтобы разрезать конкретный сегмент цепи. Выбор именно этой эндонуклеазы был вполне обоснован: если бы Ясин выбрала случайный фермент, то он бы повсеместно разрезал геном, не только затрудняя интерпретацию результатов, но и нанося вред клетке-хозяину. Однако, учитывая специфичность линии из 18 букв подряд, I-Scel вырезал бы лишь одну последовательность ДНК из более чем 50 миллиардов возможных комбинаций (по иронии судьбы, у генома мыши даже не было соответствующей последовательности букв, поэтому перед попыткой эксперимента по редактированию генов Марии Ясин пришлось вставить копию последовательности в геном, чтобы фермент мог совершить расщепление в необходимом месте).
Результаты эксперимента Ясин оказались поразительны. Ей удалось заставить 10 процентов клеток точно восстановить мутировавший ген с помощью гомологичной рекомбинации. Возможно, сейчас этот показатель покажется низким, чтобы судить об успешности проведённого эксперимента, но на тот момент это был результат, в сотни раз превышающий достигнутые ранее. Это было самым многообещающим доказательством того, что процесс может позволить учёным переписать код генома без риска незаконной рекомбинации или случайного расщепления, как в случае с использованием переносчиков-ретровирусов. Всё, что требовалось от учёных, – ввести двухцепочечный разрыв в нужном месте, и клетки практически сделают всю работу за них.
С середины 1990-х годов исследователи бросились разрабатывать новые системы, которые, как I-Scel, могли бы точно нацеливаться на конкретные последовательности букв в ДНК. Учёные знали, что если они решат эту проблему, то смогут раскрыть весь потенциал редактирования генов. К системам редактирования генов следующего поколения предъявлялось три требования: они должны были способны распознавать определенную, желаемую последовательность ДНК; они должны были иметь возможность расщепить эту последовательность ДНК; и они должны были быть легко перепрограммируемы, чтобы отправлять их в отдельные участки для расщепления различных последовательностей ДНК. Соблюдение первых двух критериев было нужно для создания двухцепочечного разрыва, а третий необходим для широкого использования инструмента. I-Scel преуспел в первых двух, но с треском провалился на третьем. Чтобы создать программируемую систему разрезания ДНК, биоинженеры решили, что им нужно будет либо переоборудовать I-Scel для нацеливания и разрезания новых видов последовательностей, либо найти совершенно новый нуклеазный фермент, который уже эволюционировал до возможности расщепления различных последовательностей ДНК.
Усилия учёных по реорганизации I-Scel не увенчались успехом (что неудивительно, учитывая огромную молекулярную сложность белковых ферментов), и быстро стало очевидно, что поиск других нуклеазных ферментов будет гораздо более перспективным подходом. Фактически, после эксперимента Марии Ясин с I-Scel, учёные уже выделили десятки нуклеаз из широкого спектра организмов и определили точные последовательности ДНК, на которые они нацелены. Но была фундаментальная проблема: подавляющее большинство этих ферментов распознавало последовательности длиной всего шесть или восемь букв – слишком короткие для того, чтобы быть полезными. Эти последовательности встречались в человеческом мире десятки тысяч или даже сотни тысяч раз в человеческом геноме, что означает, что даже если бы нуклеаза могла стимулировать гомологичную рекомбинацию в одном гене, она уничтожила бы почти весь геном в процессе. Клетка будет уничтожена, прежде чем она сможет начать восстановление ДНК.
Исследователи не могли полагаться ни на одну из уже известных ранее нуклеаз, и было нецелесообразно искать новые ферменты для расщепления ДНК, такие, как I-Scel, всякий раз, когда возникала необходимость редактирования нового гена. Если редактирование генов в лечебных целях должно было стать действительным методом исправления мутаций, вызывающих заболевания, врачи не могли просто ждать, пока учёные придут к открытию той нуклеазы, которая будет целенаправленно рассекать конкретную область гена, в котором у пациента обнаруживалась вредоносная мутация.
В 1996 году было проведено исследование, меняющее парадигму, которое представило решение этой проблемы. В исследовательском университете Балтимора профессор Сринивасан Чандрасегаран понял, что вместо создания нуклеаз с нуля, поиска новых в природе или переделывания I-Scel он может использовать гибридный подход, выбирая части белков, которые существовали в природе, и комбинировать их. Он считал, что такие химерные нуклеазы будут отвечать первым двум требованиям нуклеазы, необходимой для редактирования генов: они смогут распознавать и вырезать определенную последовательность ДНК.
Чандрасегаран приступил к экспериментам с химерной нуклеазой, пытаясь адаптировать её для расщепления последовательности ДНК на определённых отрезках. Но как же внести двухцепочечный разрыв именно туда, куда нужно? Собственно задачу разрезания ДНК отлично выполняет нуклеаза Fold – белок, способный разрезать любую последовательность ДНК на некотором расстоянии от места распознавания. Именно его и применил профессор для своих экспериментов. Он использовал семейство встречающихся в природе белков, называемых белками цинковых пальцев, которые названы так, потому что они распознавали ДНК, используя удлинения, похожие на пальцы, удерживаемые вместе ионами цинка и расположенные рядом, как пальцы руки. Каждый цинковый палец, или ZFN
Невероятно, но способ, открытый Чандрасегараном, работал. Его команда наглядно продемонстрировала, что, комбинируя разные цинковые пальцы, можно создать белок, который в клетке будет направленно привлекаться к определенной последовательности ДНК. Если прикрепить такой домен к нуклеазе, то полученный белок будет разрезать ДНК только в нужном месте! Вскоре Чандрасегаран стал сотрудничать с профессором Университета Юты Даной Кэрролл с целью научиться использовать эти цинксодержащие белки-нуклеазы. Вместе учёные продемонстрировали, что ZFN так же эффективны, если применить их к клеткам лягушек (популярная модельная система для биологов), и что ZFN-индуцированное разрезание ДНК стимулирует гомологичную рекомбинацию. Затем, проводя эксперименты на плодовых мушках, учёные из лаборатории Кэрролла запрограммировали новые ZFN для нацеливания на ген, участвующий в пигментации желтого тела, и показали, что эта стратегия может привести к точным генетическим изменениям в целом организме. Это стало очень важным событием для генного редактирования. Мало того, что ZFN были достаточно практичны для использования на животных, но, что было ещё более важным, они могли быть адаптированы для таргетинга на новые гены.
Более широкому научному сообществу, наблюдавшему за исследованиями учёных в области редактирования генов, достижение пришлось по нраву и возымело такой успех, что они тут же принялись разрабатывать ZFN для своих целей, пытаясь нацелить и на новые гены и работая над новыми моделями живых организмов. В 2003 году Мэтью Портеус и Дэвид Балтимор стали первыми, кто показал, что ген в клетках человека может быть точно отредактирован с помощью специально созданного ZFN. Вскоре после этого профессор генетики, геномики и эмбриологии Федор Урнов и его коллеги исправили мутацию, вызывающую Х-связанный тяжелый комбинированный иммунодефицит. Федор Урнов и его коллеги работали над человеческими Т-клетками с мутацией в гене, ответственном за Х-связанный тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID-X).
Они сконструировали ДНК-нуклеотиды с сильным сродством к мутации гена DICS-X. В присутствии двухцепочечной ДНК, называемой донором, введенной с плазмидой и несущей здоровую версию гена, эти нуклеазы вызывают расщепление ДНК, создавая благоприятные условия для гомологичных рекомбинаций между ДНК донора и ДНК клетки. Казалось, возможность использования стратегии редактирования генов для выявления генетических заболеваний никогда не была более реальной прежде!
Между тем ZFN были также приняты к использованию лабораториями, заинтересованными в редактировании генов для совершенно разных целей, таких как производство точно спроектированных сельскохозяйственных культур или моделей животных. В конце 2000-х годов эта технология была успешно применена к растениям табака и кукурузе, демонстрируя, что двухцепочечные разрывы ДНК способствовали высокоэффективной гомологичной рекомбинации во многих типах клеток, а не только в клетках млекопитающих. Одновременно стали появляться сообщения о том, что ZFN использовались для модификации генов у рыб, червей, крыс и мышей. Эта интригующая работа привлекала внимание всё большего числа различных специалистов благодаря захватывающему потенциалу.
Но несмотря на многообещающие эксперименты, ZFN никогда не были широко приняты вне кулуаров. Исследователи, которые использовали их, имели большой опыт в области белковой инженерии, сотрудничали с несколькими лабораториями, которые уже имели подобный опыт применения ZFN, либо же большие кошельки, чтобы платить за конструирование необходимой именно им нуклеазы. Проектирование ZFN оказалось простым – всё, что было нужно сделать учёным, – это просто объединить различные сегменты цинкового пальца таким образом, чтобы они распознавали последовательность ДНК, которую требовалось редактировать. Но применить данный маневр на практике было очень сложно. Большая часть недавно разработанных ZFN просто не распознавала последовательности ДНК, как ожидалось; другие же могли точно распознать участок ДНК для расщепления, но проблемы возникали в ходе последнего.
По тем же причинам, по которым переоборудование I-Scel оказалось непростым, учёным не удалось сделать и ZFN достаточно удобным и полезным инструментом для редактирования генома. Безусловно, результаты экспериментов с ZFN убедительно доказали, что спроектированные нуклеазы – подспорье на пути к цели редактирования генов, но данная область всё ещё ждёт появления качественного нового вида технологии, которая будет более надежной и простой в использовании.
Эта технология – по крайней мере, первая её версия, – была открыта в 2009 году, она основана на исследованиях новых типов белков, обнаруженных в бактериях рода Ксантамона, патогенных бактериях, заражающих растения. Из них были выделены эффекторы, подобные активаторам транскрипции, белки под названием TALE
Поделиться книгой: