Помоги проекту - поделись книгой:
Сейчас твердо установлено, что 1) изменение относительной концентрации мРНК часто не меняет уровень синтеза. И наоборот, концентрация белка в цитоплазме может меняться независимо от концентрации мРНК; 2) изменение концентрации отдельного белка не изменяет функциональную активность органеллы; 3) изменение специфической активности белка ин витро (в пробирке) часто не отражает соответствующих изменений в соответствующих реакциях в клетке.
С одной и той же первичной мРНК может быть получено несколько тысяч вариантов зрелых мРНК. Это число варьирует от организма к организму. Однако пока до конца не ясна граница между интроном и экзоном. На первичной мРНК может быть несколько мест, с которых может начинаться зрелая мРНК, может быть несколько вариантов вырезаемых кусков. Из-за альтернативного сплайсинга могут получаться белки, у которых небольшие сегменты на концах или в центре будут отсутствовать. Такие белки называются функционально сходными изоформами одного и того же белка. В некоторых организмах мРНК может формироваться путем сплайсинга вместе (соединения в одну мРНК) экзонов из двух разных незрелых мРНК (182. С. 61).
Но даже зрелая мРНК может потом быть модифицирована путем включения нескольких дополнительных нуклеотидов или замены одного нуклеотида на другой (182. С. 61). Наиболее распространенной формой редактирования РНК у высших эукариот является превращение аденозина в инозин в двухцепочечных РНК, которое осуществляется ферментом аденозиндеаминазой. Поэтому белок может, оказывается, даже быть не записан в виде ДНК. Один ген дает сотни, тысячи вариантов белка. Миллионы генов могут дать один и тот же белок. Получается, что существуют белки без соответствующих генов. То есть один ген ― много белков.
Однако догма "один ген ― один фермент" тоже оказалась не верной. Если ген есть совокупность экзонов и интронов с альтернативным сплайсингом. Функция гена может реализовываться через другой ген или продукт гена, например группы крови. Кроме того, на функцию данного белка влияет сложнейшая система клеточной сигнализации, система внутриклеточного транспорта, пострансляционной модификации белков и т. д.
Многофункциональность белков ― другая проблема для формальной генетики. Белок может функционировать в разных функциональных путях в зависимости от контекста (182. С. 64). В организме человека распространены белки с двумя функциями, совершенно независимыми друг от друга. Это, например, белок БАРС, который участвует в регулировании транскрипции генов и одновременно в цитоплазме участвует в функционировании белковой машины, обеспечивающей отщепление пузырьков от мембран (233).
Функция структурного или каталитического белка зависит не только от последовательности нуклеотидов, но и от окружающего генетического контекста, например, от структуры хромосомы, в которую ген попал, если хромосома в данной клетке конденсирована, то ген в одной хромосоме совсем не читается, а в другой может читаться. Если он есть в другой хромосоме, то он читается. Уровень синтеза определенного белка требует клеточной регуляции. Есть ещё вопросы, какой белок и когда синтезировать. И это зависит от того, в каком состоянии находится ДНК, нет ли метилирования цитозина?
Но и это ещё не все. Многие белки имеют перекрывающуюся функцию. Если, например, убрать из клетки белок синтаксин 5, один из белков группы СНАРЕ, то есть белков, участвующих в сближении мембран внутриклеточных мембранных органелл для их слияния между собой, то клетка выживает, так как СНАРЕ из других, ближайших, ступеней внутриклеточного транспорта ее замещают, смещаясь на место, где раньше работал синтаксин 5 (200).
Наличие интенсивного редактирования незрелой мРНК, наличие регуляторных механизмов на этапе синтеза белков, наличие посттрансляционной модификации белков резко затрудняет не только структурное, но и функциональное определение гена. Все это резко затрудняет даже определение гена как структурной единицы генома. В результате всех этих открытий ген потерял свою спецификацию и свойство хранения информации стабильность. До сих пор гены называют мозгом клетки, а это в корне не верно.
4.6. ПРОГРАММА РАЗВИТИЯ
Было обнаружено, что гены (даже в самом современном понимании) не автономны, имеется координированная программа синтеза белков и ее исполнение контролируется. ДНК сама по себе не может передавать информацию от одного поколения к другому без искажений (182. С. 145). Только 82,5 % глобальной вариабельности фенотипа зависит от генотипа (243). Между тем организм с огромной точностью проходит по стадиям своего индивидуального развития и это происходит несмотря на возмущения, поступающие из внешней среды. Это цепь реакций с обратной связью и чувствованием (тестированием) окружающей среды. Стадийность развития зачастую зависит от присутствия в нужном месте и в нужное время только нескольких молекул нужного белка (182. С.105). Ещё в 1932 г. Морган задал себе вопрос ― как развиваются сложнейшие многоклеточные организмы, как гены продуцируют свои эффекты? Сейчас многое, хотя и не все, стало уже известно. Как регулируется образование организма? За счет синтеза и транспорта на плазматическую мембрану специальных белков рецепторов и лигандов. Этот процесс очень сложен. Рецепторы и биология развития. Все начинается с асимметрии зиготы. Есть данные о том, что молекулы мРНК двигаются к одному полюсу яйцеклетки по цитоскелету (229).
У многоклеточных организмов большинство меток организма содержит полный набор генов, но обычно из этого набора используется крайне незначительный объем информации.
Постоянно информация считывается только с тех гены, которые кодируют структурные белки и ферменты промежуточного метаболизма. Кроме этих постоянно необходимых генов имеется много других генов, активных только в определенных типах клеток, при определенных метаболических условиях или во время дифференцировки. Синтеза белка активируется по мере надобности и регуляция данного процесса чрезвычайно сложна.
В свое время я скушал доклад, сделанный в Европейской молекулярно-биологической лаборатории и в университете города
Данди (Шотландия), где было показано, что короткие полипептиды-лиганды, то есть небольшие по размерам белки, содержащие сигналы для белков, которые их детектируют, то есть белков-рецепторов, после секреции во внеклеточное пространство не просто диффундируют по внеклеточному пространству, а активно захватываются и транспортируются клетками через свою цитоплазму.
Я не буду подробно описывать основные эксперименты по биологии развития, эксперименты с пересадкой конечностей, зачатков, закладок органов и т. д. Это не входит в мою задачу, а Интересующий читатель легко найдет все это в Википедии.
Боннер (136) пишет, что каждый тип специализированных клеток высших организмов содержит характерные для них ферменты, но каждая продуцирует только часть ферментов, для которых их геном содержит всю информацию Он отмечает: ясно, что ядро содержит некоторые другие механизмы, которые определяют в каких клетках и через какое время в течение развития каждый ген должен быть активирован и произвести свою мРНК, и в каких клетках каждый ген должен оставаться неактивным, подавленным. Должна быть другая информация, не только та, что заключена в ДНК и обеспечивает синтез белка для того, чтобы объяснить клеточную дифференцировку". Центральная догма молекулярной биологии описывает механизмы, обеспечивающие тот факт, что все клетки сходны, но она оставляет вопрос открытым, как клетки высших организмов становятся разными.
Голубовский (25) отмечает: "Роль, время и место действия большинства "генов-номинантов" пока совершенно неясны. Но есть и другая проблема. Под геномом надо понимать всю наследственную систему, включая не только структуру определенного набора ДНК элементов, но и характер связей между ними, который определяет ход онтогенеза в конкретных условиях среды. Налицо системная триада: элементы, связи между ними и свойства целостности. Отсюда следует важный вывод: знание структуры генов на уровне ДНК — необходимо, но вовсе недостаточно для описания генома. Мы лишь на пороге постижения динамического способа организации и неканонических форм наследования". От себя добавлю ― молекулярная биология пока совершенно не представляет, что делать с тем огромным количеством деталей, касательных известных ныне молекулярных машин, с тем огромным числом открытых взаимодействий между белками.
Появление возможности использовать полную информацию о геноме привело к возникновению функциональной геномики, вместо структурной геномики. "Гены" включаются-выключаются через их взаимодействие во время эмбрионального развития. Геном включается и выключается в зависимости от самого развития, что позволяет исправлять ошибки. Новым направлением в молекулярной биологии стало использование термина генетическая программа вместо слова ген. Термин генетическая программа заимствован из области компьютерных программ. Она приравнивает генетический материал яйца магнитной записи на диске компьютера, где отражается (при выходе из программы) опыт ее использования. То есть она при каждом цикле чуть переписывается, будучи в целом одной и той же. В генетической программе равноправной или не менее существенной является генетическая и иная информация, содержащаяся в цитоплазме яйцеклетки и центриоле (особая органелла, которая постоянно находится в центре тяжести клетки) сперматозоида. Реализация генетической программы предписана ее наследственностью, подобранной во время формирования вида (207).
Ещё более точен термин "программа развития". Впервые термин "программа развития" ввел М. Аптер (цит. по 182). По его словам, гены ― аналоги субпрограмм по синтезу различных белков. "Цитоплазма содержит программу, специфицирующую природу и последовательность операций, комбинирование с множеством специализированных различных форм этих событий, которые проявляются во время самого развития."
По сути, понятие "программа развития" похоже на компьютерные программы, которые восстанавливают свою работу даже, если случаются проблемы ― она может удалять и исправлять случайные ошибки. Это интерактивная программа, которая отлеживает окружающую обстановку и в зависимости от окружающей ситуации включает ту или иную компенсационную программу.
Гены есть программы, которые реализуются только с участием других программ. Не может одна программа все обеспечить. Наследственная информация реализуется через взаимодействие белков, не через один белок, а через взаимодействие НЕСКОЛЬКИХ (до тысяч) белков. Поэтому прямой связи между геном и признаком не может быть даже теоретически. Любая информация, заложенная в гене, ВСЕГДА опосредуется через весь геном.
Если нет полного набора программ, то все встанет. Очень похоже на ситуацию в компьютере, когда программа обращается к программе калькулятору. Так и геном ― набор компьютерных программ, которые взаимодействуют. Очень важна совместимость программ друг с другом и с цитоплазматическими факторами наследственности. Как программы для компьютеров ПС не всегда совместимы с программами для Макинтошей. Мутация ведет к ошибкам взаимодействия программ.
Программа развития формируется при слиянии яйцеклетки и сперматозоида и включает проверенную на гибридизационную совместимость нуклеиновых кислот геном, который состоит из материнской и отцовской половины, отцовской центриоли и наследственных факторов, заключенных в цитоплазме яйцеклетки. Там имеются гены митохондрий и запас белков, созданных в организме матери. Уже сама по себе яйцеклетка оказывается асимметричной.
Программа развития или генетическая программа включает в себя комплекс механизмов, по сути, весь организм, где ДНК, РНК и белки функционируют попеременно и как инструкции и как данные (182. С. 144). Набор генов приобретает свойства саморегулирующейся динамической системы, в которой ДНК предоставляет важный и абсолютно незаменимый, но сырой материал, не более (182. С. 71).
Уже Б. Мак-Клинток в своей Нобелевской лекции описала геном как очень чувствительный орган клетки, отслеживающий свою активность и корректирующий общие ошибки, чувствуя необычные и неожиданные события и реагирующий на них. Геном, как команда в футболе. Никогда не знаешь, заиграет команда из лучших игроков или нет, пока не попробуешь.
Моделирование на компьютере стало мощным инструментом для понимания программы развития. Применение инженерных принципов тоже помогает понять поведение программы развития. Например, эмбриогенез и поведение автопилота на самолете обнаруживают сходные характеристики, активность их определяется целью. В программе развития заложены инженерные принципы:
1. Положительная и отрицательная обратные связи.
2. Программа разделена на множество независимо выполняемых актов: детектирование ― действие. Детектирование случайностей.
3. Имеется множество параллельных циклов работ, выполняемых одновременно.
4. Функциональная единица реагирует только на сигналы из своего ближайшего окружения.
5. Точный и множественный контроль исполнения на промежуточных стадиях.
6. Резистентность к неудачам и ошибкам.
После оплодотворения яйцеклетки зигота работает как компьютер с множеством параллельных процессоров, если один вылетел, другие замещают. Случайный поиск других программ зависит от окружения. Зона реализации программ очень узкая. Клетка просто физически не в состоянии постоянно синтезировать все 30000 генов одновременно.
Если в нужный момент компьютер выключить, а потом включить, то будет другой организм. Например, эмбрион дрозофилы развивается нормально при 20 °C. Но если температуру временно повысить до 37 °C во время самой ранней стадии куколки, то взрослая особь не будет иметь части нормального рисунка вен на своих крыльях. Если нагревание провести 24 часа позднее (по отношению к стадийности развития), то рисунок на крыльях не будет нарушен.
Без цитоплазмы яйцеклетки соматическая клетка может дать только другую соматическую клетку. В процессе дифференцировки ядро животных клеток теряет способность давать целое животное, а даёт клетки только той же самой ткани. Для возвращения соматической клетке способности стать источником информации для развития целого организма она должна быть помещена в белковое окружение, характерное для яйцеклетки. Почему? Да потому, что в ней не вся программа развития. В цитоплазме яйцеклетки содержится огромное количество белков. По-видимому, все возможные белки, которые имеет в геноме данный вид. Скорее всего, происходит как бы тестирование гибридизационной совместимости.
Развитие ― это нечто более сложное, чем набор инструкций, записанных на алфавите нуклеотидов (182). Индивидуальное развитие включает три этапа, 3 части. Развитие, поддержание развитого организма, старение. Но это один процесс из 3 разных частей, заканчивающийся программированной гибелью. Если сделать программу жесткой, как в компьютере, то не будет целого организма. Огромная роль принадлежит взаимодействию генотипа со средой. Любой единичный акт поведения (физиологии или морфологии) каждого единичного организма жившего на Земле определяется взаимодействием генетической информации, сохраняемой в развивающемся организме, с окружающей средой, ее свойствами. Однако проявление некоторых признаков слабо зависит от окружающей среды, например, люди почти всегда имеют 5 пальцев на каждой руке практически при любой окружающей среде. Другие признаки более чувствительны к воздействию окружающей среды. Программа развития постоянно реагирует на основе обратной связи на то, как идет развитие. Ремоделирование и реструктурирование хроматина важно для программы развития. Программа развития содержит часть программы предыдущего организма в виде цитоплазмы яйцеклетки. Вот, например, ряд инструкций развития, которые реализуются на уровне дробящегося зародыша: 1) разделись тангенциально с одновременным ростом; 2) разделись поперек с одновременным ростом; 3) расти без деления; 4) проведи тест на величину и число клеток… Генов, персонально ответственных за эти команды, не существует.
В генетической программе равноправной и существенной является генетическая информация, содержащаяся в цитоплазме яйцеклетки и в центриоле сперматозоида, то есть женских и мужских половых клеток. В яйцеклетке, по сути, остается белковая наследственность от предыдущего животного, хотя при этом информация, записанная в ДНК, имеет определяющую роль. Без нее развитие не может быть реализовано.
Итак, развитие организма ― это сумма последовательной реализации и взаимодействий многих различных генов в пространстве и времени, а шум развития ― это малые вариации в признаках. В процессе развития функционирует как бы генетически переключаемая сеть, в которой, чем более общая команда подается, тем больше генов включено. И ученых ещё только предстоит узнать, как все эти инструкции реализуются и адаптируются.
4.7. КАК ИГРАЕТ ОРКЕСТР ГЕНОВ?
В виде аналогии геном, совокупность генов, например, человека, можно представить себе как большой симфонический оркестр. В нем имеется 30000 инструментов. Каждый инструмент есть аналогия последовательности нуклеотидов, остающейся в информационной РНК, после сплайсинга. Когда оркестр обучен, когда имеется прекрасный дирижер, то 30000 инструментов выдают "на-гора" чудную мелодию. Эта аналогия соответствует ситуации, когда внешняя среда является оптимальной для развития. Но если дирижер плохой или оркестранты не обучены, то чарующая музыка превращается в нечто, лишь напоминающее эту чарующую музыку.
Другой симфонический оркестр ― это другой организм. В нем все те же 30000 инструментов ― генов, но некоторые инструменты имеют небольшие дефекты, например кнопка на флейте западает или ещё что сломано. Если снова оркестрантов научить и поставить очень хорошего дирижера, то можно получить неплохую музыку, но уже хуже той оптимальной. Но, если оркестранты не обучены, и дирижер плохой, то музыка все еще будет напоминать оригинал, но очень и очень отдаленно.
Возьмем теперь тот же оркестр, тот да не тот. У него инструменты попорчены и изменены уже существенно, но все равно они очень и очень похожи на те оригинальные инструменты. Например, глубина вдавливания кнопок на саксофонах гораздо выше. Кроме того партитура чуть другая и инструменты адаптированы, чтобы исполнять именно эту партитуру. Хотя основная мелодия прослеживается. Но звуки совершенно не комбинируются. Это новый вид, но в пределах того же семейства, мелодии. Если ряд инструментов убран или другой ряд удвоен, да и мелодия чуть другая, то возникает третий вид. Но он тоже зависит от дирижера и оркестрантов. Но всегда набор инструментов практически одинаков.
Возможна и другая аналогия. Есть ноты в магазине. Музыка записана в нотах, но пока ее не сыграют, произведение не существует. Нотная запись в партитуре для оркестра ― это мРНК. В биологии получается, что как отметила Келлер, что исполнитель музыки, той, что записана в партитуре, одновременно с исполнением переписывает партитуры ― это мРНК. Звук или звуковая фраза ― это белок. Ноты производят для нескольких инструментов ― это ДНК. Ее делят на партитуры для каждого музыканта, удаляя ненужные куски интроны, мРНК, их уже исполняют. Белки ― это звуки, но их качество зависит от инструментов.
Симфонический оркестр подбирается таким образом, чтобы он выдавал сносную мелодию, а не одни барабаны, воспроизводил бы все звуки без резонанса некоторых инструментов. Итак, в рамках данной модели все гены-инструменты почти одинаковы, а музыка существенно разнится. Никакого соответствия между
О том, что концепция программы развития точнее отражает механизмы наследования, чем концепция гена, говорит и судьба овечки Долли (см. Приложение IV)
Итак, понятие гена больше не является научным, наследование определяется не каким-то особым наследственным веществом, не только последовательностями нуклеотидов, но и надгенетическими факторами. Отдельного генетического вещества нет. 1. ДНК не изолирована от клеточного метаболизма. Сама ДНК и ее компоненты метаболизируются клетками, имеются даже болезни (подагра), связанные с нарушениями метаболизма ДНК.
2. ДНК не единственное вещество, способное передавать наследственную информацию ― имеет место наследование через РНК в яйцеклетке и при вегетативной гибридизации (привой-подвой, см. раздел 9.1). Кроме того имеется надгенетическое наследование, наследование через ДНК и РНК митохондрий, наследование наследование через цитоплазму: через цитоплазматические белки яйцеклетки, прионы и другие подобные типы наследования… Следовательно, прав Лысенко, а не формальные генетики.
ГЛАВА 5. ПОСТТРАНСЛЯЦИОННОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ БЕЛКОВ
5.1. ПОСТРАНСЛЯЦИОННОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ БЕЛКОВ
Синтез аминокислотной цепочки знаменует только начало всей истории получения конечного продукта. Существенными моментами экспрессии генов (проявления информации, записанной в гене, в виде ее конечного продукта ― зрелого белка) являются не только посттранскрипционные модификации мРНК, но и пострансляционные (то есть происходящие уже после синтеза цепи аминокислот, постсинтетические) модификации белков. Посттрансляционные модификации белков необходимы для их полноценного функционирования. При этом осуществляются эти модификации с участием множества других белков, а значит, и кодирующих их генов (в обычном понимании слова) а они тоже могут иметь разный уровень экспрессии и могут подвергаться мутациям. Следовательно, модификации изменения РНК и белков не могут быть осуществлены без участия генома в целом.
Одни белки после синтеза остаются в цитоплазме. Белки могут полностью переноситься в просвет эндоплазматической сети и терять связь с мембраной. Эти белки называются растворимыми, то есть не связанными напрямую с липидной мембраной. Далее растворимые белки могут либо оставаться в просвете эндоплазматической сети, либо транспортироваться до соответствующих органелл по ходу секреторного транспортного пути (промежуточные органеллы, пластинчатый комплекс Гольджи, органеллы, расположенные между комплексом Гольджи и плазматической мембраной, эндосомы, лизосомы), либо доставляться к плазматической мембране для последующего выделения (секреции) во внеклеточную среду.
Белки, могут быть предназначены для выведения во внешнюю среду или для доставки в лизосомы, пластинчатый комплекс или они могут оставаться в эндоплазматическая сеть. Эти белки называются секретируемыми. Небольшая часть растворимых белков, оказывающихся в просвете эндоплазматическая сеть, являются лизосомными ферментами, они предназначены для доставки в лизосомы. Наконец, есть белки, которые остаются в просвете эндоплазматической сети. К ним относятся некоторые шапероны, белки, ответственные за правильную трехмерную упаковку белковых молекул, а также участники специализированных для эндоплазматической сети белковых агрегатов, контролирующих выход секретируемых белков и лизосомных ферментов из эндоплазматической сети.
В гранулярной эндоплазматической сети происходит и синтез экспортируемых белков, которые, встраиваясь в мембрану эндоплазматической сети, становятся интегральными (то есть встроенными в липидной бислой) мембранными белками.
Мембранные белки могут быть следующих типов. Одни переносятся на митохондрии, другие остаются в эндоплазматическая сеть или транспортируются в органеллы-пероксисомы. Наконец, третья часть белков транспортируется в сторону АГ и проходит через него, направляясь либо на плазмалемму, либо в эндосомы, либо в лизосомы. Сходный путь проходят липиды, продуцируемые на цитоплазматической стороне мембран эндоплазматической сети.
Превращение линейной немодифицированной пептидной (аминокислотной) цепи в полноценный функциональный белок (созревание) осуществляется в результате многостадийного процесса, который начинается сразу же после начала трансляции и протекает либо в цитоплазме, либо в просветах эндоплазматической сети, пластинчатого комплекса Гольджи, эндосом и лизосом. Поэтому все процессы пострансляционной модификации могут быть разделены на те, что обеспечиваются белками, связанными в секреторным транспортным путем, и белками, расположенными в цитоплазме.
5.2. ПОСТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ ВНУТРИ ОРГАНЕЛЛ СЕКРЕТОРНОГО ТРАНСПОРТНОГО ПУТИ
В просвете органелл секреторного транспортного пути происходят следующие модификации белков: 1) отрезание небольших участков аминокислотной цепи, 2) образование дисульфидных мостиков и последующая пространственная упаковка цепочки аминокислот, 3) присоединение линкера (молекулы, которая склеивается с просветными белками) GPI (ДЖИПиАй) и других подобных соединений, 4) присоединение моносахаров с формированием полисахаридных цепочек.
1. Отрезание кусков аминокислотной цепочки является одним из наиболее общих способов посттрансляционной модификации белков. К таким участкам относятся сам сигнальный пептид, который отрезается от аминокислотной цепи растворимых белков, попавших в просвет эндоплазматической сети. Сюда же относятся пропептиды (небольшие кусочки, отрезаемые в процессе транспорта от лизосомальных ферментов и белков, секретируемых при возникновении соответствующего сигнала) у ферментов лизосом и пропептиды белков, подвергающихся секретированию под воздействием сигналов из внешней среды, а также N и С концы у проколлагенов… Зачем клетке нужно удалять тот или иной пептид на концах аминокислотной цепи? Для того, чтобы увеличить эффективность транспорта белка (см. Приложение V) или для того, чтобы увеличить эффективность его каталитической функции.
2. Свертывание белка в определенную пространственную форму имеет важнейшее значение для его функционирования.
Свертывание происходит в просвете эндоплазматической сети и в цитоплазме. Правильному свертыванию помогает образование дисульфидных связей. Образование дисульфидных мостиков происходит в просвете эндоплазматической сети. Путём окисления боковых цепей цистеина образуются дисульфидные мостики, правильность положения которых контролируется протеиндисульфид-изомеразой. Пептидилпролил-изомераза контролирует в синтезируемом пептиде реакцию так называемой цис-транс-изомеризации между пролином и другими аминокислотами.
Кроме того, для того чтобы растущая полипептидная цепь могла свернуться необходимым образом, с еще линейным участком цепи временно связываются шапероны. Белки-шапероны участвуют в формировании трехмерной структуры цепочки аминокислот данного белка. Эти белки направляют процесс свертывания цепи путем подавления нежелательных побочных взаимодействий.
Когда вновь образованный белок приобретает правильную вторичную и третичную структуру он проверяется на правильность упаковки. Этот процесс реализуется также шаперонами. Например, если после начального этапа гликозилирования на концевых остатках полисахаридных цепей нет глюкозы, то шаперон не присоединяется к данному экспортируемому белку и наш белок выпускается из эндоплазматической сети.
После этого белки начинают концентрироваться в специальных местах на шероховатом эндоплазматическом ретикулуме. эти места называют выходными сайтами или выходными дверями из эндоплазматической сети. Их строение очень специфично. Они представляют собой ветвящиеся в пространстве сплетения, состоявшие из коротких трубочек и мембранных почек. Эти трубчатые сплетения содержат повышенные концентрации белков-СНАРЕ и здесь же происходит концентрация мембранных белков, идущих на экспорт вдоль секреторного пути (см. Приложение V).
3. Пришивание GPI (ДЖИПиАй) к одной из аминокислот нужно для того, чтобы потом белок связывался с определенной липидной молекулой и функционировал почти как мембранный белок. Это происходит в просвете эндоплазматической сети или пластинчатого комплекса Гольджи.
В эндоплазматической сети происходят следующие химические модификации белков: соответствующая пептидаза отщепляет сигнальный пептид. Фермент узнает точку расщепления в составе специфической N-концевой последовательности белка. Путем окисления боковых цепей цистеина образуются дисульфидные мостики, правильность положения которых контролируется протеиндисульфид-изомеразой. Специальный фермент пептидилпролил-изомераза контролирует цис-транс-изомеризацию Х-Рго-связей в синтезируемом пептиде. Трансгликозидазы переносят олигосахариды в блоке с долихолом (длинноцепочечным изопреноидом) на определенные остатки аспарагиновой кислоты в белке, тем самым осуществляя N-гликозилирование белка. Гликозидазы "подстригают" олигосахариды, отщепляя избыточные остатки глюкозы и маннозы. Для того чтобы растущая полипептидная цепь могла свернуться необходимым образом, с еще линейным участком цепи временно связываются шапероны. Эти белки направляют процесс свертывания цепи путем подавления нежелательных побочных взаимодействий. Наиболее важным шапероном, присутствующим в просвете ШЭР, является белок связывания (45).
Когда вновь образованный белок приобретает правильную вторичную и третичную структуру и остатки глюкозы удалены полностью, он перемещается в аппарат Гольджи.
В аппарате Гольджи осуществляются следующие ферментативные стадии модификации белка: фосфорилирование и отщепление с последующим переносом (перегруппировка) остатков сахаров с помощью гликозидаз и гликозилтрансфераз. Эта модификация имеет целью образование специфической олигосахаридной структуры в гликопротеинах. Наконец, в секреторных гранулах отщепляется еще один пептид, прежде чем содержимое секретируется посредством экзоцитоза. Это отщепление, катализируемое специфичными пептидазами, выполняет функцию активации секретируемого белка. Например, отщепление С-пептида (очень короткой цепочки аминокислот) от неактивного проинсулина приводит к образованию активного гормона инсулина.
5.3. ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ И ЛИПИДОВ
В просвете мембранных органелл секреторного транспортного пути мембранные белки, также, липиды, как и растворимые, могут подвергаться различным модификациям. Наиболее характерной из них для эндоплазматической сети является первичное гликозилирование ― ковалентное связывание белковой цепи со сложным олигосахаридом. В результате этого синтезирующийся белок становится гликопротеидом. Процесс присоединение моносахаров с формированием полисахаридных цепочек носит название гликозилирования белков. Гликозилирование белков обычно происходит в просвете органелл секреторного транспортного пути и редко бывает в цитоплазме.
Ферменты транс-гликозидазы переносят олигосахариды в блоке с долихолом (длинноцепочечным изопреноидом) на определенные остатки аспарагиновой кислоты в белке, тем самым осуществляя N-гликозилирование белка. Гликозидазы правильно "подстригают" олигосахариды, отщепляя избыточные остатки глюкозы и маннозы.
Растворимые и мембранные белки, попавшие в эндоплазматическую сеть подвергаются так называемому гликозилированию, то есть процессу, в результате которого к полипептидных цепочкам присоединяются цепочки полисахаридов. Эту работу совершают специальные ферменты гликозидазы и гликозилтрансферазы. Они вместе с мембранными переносчиками моносахаров, перемещающими моносахара из цитоплазмы через липидный бислой в просвет цистерн аппарата Гольджи, составляют основу белкового состава аппарата Гольджи. Олигосахаридное ядро, состоящее из 14 мономеров моносахаров, присоединяется к той части мембранного белка, которая расположена в просвете эндоплазматической сети и также ко многим гликозилируемым белкам. Ферментов гликозилирования в АГ около 200 штук (200).
Но вначале белки должны быть правильно свернуты в пространстве. Эту задачу решают специальные белки шапероны, которые в условиях высокого восстановительного или редокс-потенциала среды, созданного в просвете эндоплазматической сети, правильно свертывают белки и закрепляют свертывание путем образования двойных соединений остатков серы.
После того, как сигнальный пептид оказывается внутри просвета эндоплазматической сети он отрезается от полипептидной цепочки, следующей за сигнальным пептидом, и эта цепочка, после завершения синтеза белка на информационной РНК, оказывается свободно диффундирующей внутри просвета эндоплазматической сети. Для того, чтобы она была правильно упакована в трехмерном пространстве, существуют специальные белковые машины, так называемые шапероны (или формообразователи). Они связываются с неправильно или неполностью свернутыми в пространстве белками и не выпускают тем самым их из эндоплазматической сети, поскольку они сами взаимодействуют с резидентными, то есть постоянно расположенными в эндоплазматической сети белками. Как только секретируемый белок свертывается правильно, шаперон уже не может к нему прикрепиться, так как локусы, ответственные за это прикрепление, оказываются внутри свернутой цепочки, будучи недоступными для шаперона. Тем самым секретируемый белок оказывается доступным для других белковых машин, ответственных за выход из эндоплазматической сети.
Большинство белков, синтезированных в гранулярной эндоплазматической сети, относится к гликопротеидам. Связывание синтезирующейся белковой цепи с олигосахаридами происходит в процессе синтеза аминокислотной цепи. При этом на белковую молекулу переносится готовый блок олигосахаридов, который связывается с аспарагиновыми остатками белковой молекулы. Этот олигосахаридный комплекс содержит 2 молекулы N-ацетилгликозамина, 9 молекул маннозы и 3 молекулы глюкозы и связан со специальным липидом долихолом на внутренней поверхности мембраны эндоплазматической сети. По мере транслокации (переноса) белковой цепи во время ее синтеза, каждый аспарагиновый остаток связывается с олигосахаридным комплексом, с помощью фермента, являющегося интегральным белком мембран эндоплазматической сети. Первичной модификации, гликозилированию, подвергаются как растворимые, так и мембранные белки, синтезирующиеся в эндоплазматической сети.
В процессе О-гликозилирования происходит присоединение одного-двух углеводных остатков преимущественно к аминокислотам серину и триптофану, но иногда и по другим аминокислотным остаткам (например, по гидроперину, как это происходит в растительных белках интенсинах). В одной молекуле полипептида может быть множество участков так называемого
О-гликозилирования. О-гликозилирование происходит без участия мембрано-связанного посредника. Существуют данные о том, что процесс О-гликозилирования начинается очень скоро после покидания белком эндоплазматического ретикулума, возможно, уже в промежуточных органеллах, то есть органеллах, которые располагаются на пути из эндоплазматической сети к аппарату Гольджи и продолжается, вероятно, вероятно, в нескольких отделах аппарата Гольджи.
N-гликозилирование осуществляется путем присоединения полисахаридной цепи к аминокислоте аспарагину, расположенному через один аминокислотный остаток от триптофана, и происходит постадийно. Процесс этот имеет следующие стадии.
1. Находясь в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме, белок взаимодействует с мембрано-связанным донором олигосахаридов долихол- фосфатом, переносящим на белок слаборазветвленную олигосахаридную цепочку, состоящую из девяти остатков маннозы и трех остатков глюкозы. Эта цепочка прикрепляется к белку через два остатка N-ацетилглюкозамина.
2. В эндоплазматическом ретикулуме работают также глюкозидаза I и глюкозидаза II, которые затем удаляют остатки глюкозы от получившегося гликопротеина. Локализованный в цис-отделе аппарата Гольджи фермент маннозидаза I удаляет четыре остатка маннозы. В так называемом медиальном Гольджи работают ферменты N-ацетилглюкозамин-трансфераза-! маннозидаза II и N-ацетилглюкозамин-трансфераза-II.
3. На транс стороне аппарата Гольджи располагаются и активно функционируют ферменты фукозилтрансфераза, галактозилтрансфераза и сиалилтрансфераза. Они завершают модификацию сахарозной цепочки, соответственно присоединяя к получившемуся гликозилированному белку моносахарид фукозу и три остатка сиаловой кислоты, то есть гликозного кольца с окисленным атомом углерода.
Важнейшее значение в регуляции посттрансляционной модификации секретируемых и мембранных белков имеют так называемые белки ферменты гликозилирования, расположенные в эндоплазматической сети и в области пластинчатого комплекса. Эти белки относятся к мембранным белкам 2 типа. Они имеют очень короткий хвост, выступающий в цитоплазму и большой участок, расположенный в просвете эндоплазматической сети и пластинчатого комплекса. Этот участок имеет ферментативную активность и именно этот свернутый в глобулу участок переносит моносахарид на цепи сахаров, прикрепленных к одной из аминокислот на цепи молекулы белка.
В аппарате Гольджи осуществляются следующие ферментативные стадии модификации белка: фосфорилирование и отщепление с последующим переносом (перегруппировка) остатков сахаров с помощью гликозидаз и гликозилтрансфераз. Эта модификация имеет целью образование специфической олигосахаридной структуры в гликопротеинах. Наконец, в мембранной тубулярной сети, расположенной на уровне транс-Гольджи отщепляется еще один пептид, прежде чем содержимое секретируется посредством экзоцитоза. Это отщепление, катализируемое специфичными пептидазами, выполняет функцию активации секретируемого белка. Например, отщепление С-пептида от неактивного про-инсулина приводит к образованию активного гормона инсулина.
Если убрать ферменты гликозилирования с помощью лекарств или с помощью модификации внешней среды, то какая-то полисахаридная цепочка будет или ингибирована или будет сверхэксперсироваться.
Если обратиться снова к аналогиям, которые я уже использовал в данной книге, то можно сказать, что во время прохода белков по транспортному внутриклеточному пути часть участков узкой магнитофонной ленты обрезается, с другой стороны, к узкой магнитофонной ленте приклеиваются куски широкой магнитофонной ленты, то есть формируется цепь, состоящая из моносахаров. Более подробное описание того, как функционирует внутриклеточный транспорт, заинтересованный читатель найдет в Приложении V.
5.4. ПОСТРАНСЛЯЦИОННЫЕ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ В ЦИТОПЛАЗМЕ
В цитоплазме белки подвергаются следующим модификациям (изменениям белковых цепей): 1) свертывание в трехмерную структуру, 2) липидизация, то есть присоединение одной или нескольких жирных кислот к аминокислотам пептидной цепи, 3) присоединение убиквинона.
1. Образование трехмерной упаковки белка в цитоплазме совершается с участием особых белков шаперонов.
2. Присоединение жирных кислот к какой-либо аминокислоте. После этого белок приобретает способность обратимо встраиваться в бислой липидов. Если таких жирных кислот пришито к белку две, то такое встраивание становится практически необратимым.
5.5. УДАЛЕНИЕ НЕИСПОЛЬЗУЕМЫХ БЕЛКОВ
Убиквитин ― небольшой белок, состоящий из 76 аминокислот. Присоединение убиквитина маркирует белок, который должна разрушить протеосома ― особый комплекс белков. Если белок не участвует в биохимических реакциях и не взаимодействует с другими белками, то его находит и метит специальный фермент, пришивая к нему короткий полипептид, называемый убиквитином. После присоединения нескольких таких остатков к нашему белку, данный белок захватывается протеосомой и разрезается.
Если продолжить поиск аналогий, то дело можно представить так. Если белок не используется в составе белкового комплекса, то он часто оказывается в цитоплазме один. Внутрицитоплазматическая милиция регулярно проводит рейды по отлавливанию таких одиночных белков-тунеядцев. Если внутриклеточная милиция встретит такие белки и увидит белок вне комплекса (помните рейды КГБ по магазинам при Андропове? Почему не на работе?), то ее сотрудники ― ферменты, ответственные за пришивание убиквитина, приклеиваются к данному одиночному белку и совершают акт убиквитинирования. Они как бы приклеивает к тунеядцу узенькую короткую узкую магнитную ленточку убиквитина. Если таких штрафов-ленточек набирается несколько, то к белку подходит протеосома и бросает в крематорий или машину для приготовления фарша мясорубку, где его разрезают.
Недавно показано, что присоединение убиквитина к белкам митохондрий ведет к их быстрому захвату в аутофагосомы, органеллы, ответственные за переваривание других органелл,(183). Аутофагосомы являются структурами, в которые клетка сбрасывает ненужные ей или поврежденные органеллы. Эти органеллы сначала отделяются от остальной массы цитоплазмы с помощью особой мембраны, а затем полученная структура сливается с лизосомами, ферменты которых и разрушают захваченные в аутофагосомы органеллы и химические соединения. Протеосома представляет собой специализированный комплекс-агрегат из нескольких белков.
Он имеет форму трубы, куда заходит меченный убиквитином белок и режется на части: на фрагменты и аминокислоты.
Итак, клетка быстро распознает те белки, которые не используются. Если белки работают, то они большую часть времени проводят в составе белковых комплексов, если белки не работают, то их, после маркирования специальной меткой, разрушает система протеосом. Если ненужные белки не убирать, то эффект будет такой же, как внедрение в геном добавочного гена или убирание одного гена из генома. Как видим, и здесь для реализации функции отдельно взятого гена требуется координированное участие сотен и тысяч других генов.
Если в качестве аналогии генома брать оркестр в целом, а в качестве аналогии белка ― звуковые фразы, то посттрансляционная модификация белка аналогична прохождению звука через усилители.
Таким образом, сама по себе информация, записанная в генах (термин используется условно) не несет полной информации даже о самом белке. Она становится полной только в рамках всего генома, после обработки синтезированной полипептидной цепи другими белками и переноса полученного белка с помощью других белков в нужное для его функционирования место.
5.6. ГЕНОТИП И ФУНКЦИЯ БЕЛКОВ
Имеется разрыв между пониманием, зачастую до мелких деталей, молекулярных механизмов работы белковых машин и общим пониманием физиологии процесса наследования, процессов транспорта. За последние несколько лет они расшифровали полные последовательности ДНК геномов множества организмов. В 2009 году список живых существ, генетический паспорт которых появился у ученых, пополнили лошадь, корова, сорго, картофель и кукуруза. Само по себе клонирование и идентификация нового белка ничего не даёт. Нужно установить его функцию.
После того, как ученые расшифровали геном, то есть полную последовательность нуклеотидов во всей ДНК человека и ряда других организмов, встал вопрос, а что делать дальше. Думалось, что наличие данной информации резко ускорит развитие молекулярной биологии. На самом деле этого не произошло. А дело в том, что пока никто не знает точных механизмов работы даже отдельно взятой клетки, не говоря уже о том, как развивается во время эмбриогенеза сложнейший многоклеточный организм. Наверное, единственный крупный результат программы по расшифровке ДНК у человека ― это тот факт, что теперь достаточно легко идентифицируются белки, задействованные в различных заболеваниях и при различных экспериментальных воздействиях.
Поделиться книгой: