Помоги проекту - поделись книгой:
Мы уделили уже много внимания возрастным изменениям структур, содержащих генетическую информацию или непосредственно участвующих в реализации этой информации. В одной из своих статей Ф. Крик заметил: молекула ДНК такова, что интересная информация о ней может быть практически неисчерпаемой. О механизмах повреждения ДНК при старении, наверное, можно сказать примерно то же.
Однако помимо процессов, происходящих в ДНК и РНК, существует множество иных интересных биологических явлений, связанных со старением. Сейчас мы рассмотрим ряд возрастных изменений негенетических структур.
Одна из основных функций клетки состоит в обеспечении энергией всех протекающих в ней биосинтетических процессов. Активный транспорт веществ, выполнение различного рода специализированных функций, например сокращение мышц, передача нервного импульса и т. д., обеспечиваются энергией при участии аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) — универсального донора энергии в клетки. Синтез же АТФ в клетке сопряжен с окислением кислородом различных метаболитов в митохондриях (этот процесс синтеза АТФ называется окислительным фосфорилированием) или в результате гликоза, протекающего вне митохондрий и без участия кислорода.
Исследованию изменений концентрации АТФ в процессе старения клетки было посвящено очень много работ. Результаты этих работ приводят к заключению, что при старении экспериментальных животных в ряде их органов может происходить значительное снижение содержания богатых энергией соединений. Хотя из этого правила есть исключения, но и при нагрузке организма выработка таких соединений, т. е. эффективность адаптации и регуляции энергообеспечения функций, в старости также, как правило, снижается.
Таким образом, один из подходов к увеличению функциональной способности клеток и органов, к торможению преждевременного старения может состоять в увеличении содержания в клетке АТФ. Добиться этого, не нарушая регуляции тех или иных путей метаболизма, очень непросто. Кстати, не надо пытаться достигнуть этого, потребляя препараты АТФ, в частности, потому что молекулы АТФ поступают в клетку с очень и очень малой скоростью. Но увеличить содержание АТФ в клетке можно непрямым путем.
М. Н. Кондрашовой и ее сотрудникам (лаборатория функциональной биофизики митохондрий Института биофизики АН СССР) удалось найти средства (это одна из солей янтарной кислоты и адреналин в очень небольших концентрациях), с помощью которых они "нормализовали" содержание АТФ в печени старых крыс. Хотя возможности коррекции биохимических изменений при старении мы в этих главах специально не рассматриваем, я привел эти данные, потому что в названной работе наблюдали не только увеличение содержания АТФ, но и другие изменения параметров "энергетического статуса" клеток печени старых животных, приближающие их по этим параметрам к клеткам молодых животных.
Одновременно подобного рода исследования помогают в определении "критических" звеньев в метаболизме и механизмов возрастных изменений "энергетических станций" клетки-митохондрии. В изучение этих изменений внесли существенный вклад отечественные биологи, особенно М. Н. Кондрашова, Е. И. Маевский, Ю. Г. Каминский и Е. А. Косенко в Институте биологической физики АН СССР; А. И. Зотин с сотрудниками в Институте биологии развития АН СССР; Л. Н. Богацкая и А. Я. Литошенко с сотрудниками в Институте геронтологии АМН СССР; В. В. Лемешко в Харьковском государственном университете.
В клетках не только экспериментальных животных, но и человека обнаружены возрастные изменения митохондрий. Например, результаты электронно-микроскопического исследования лимфоцитов людей различного возраста свидетельствуют о существенном изменении митохондрий в процессе старения. Так, при сравнении митохондрий лимфоцитов людей в возрасте до 50 лет (1-я группа), 60–69 лет (2-я); 70–79 (3-я); 80–89 (4-я) и старше 90 лет (5-я) число лиц с поврежденными митохондриями составляло 9, 55, 66, 64 и 50 % соответственно. В течение 6-летнего (лонгитудинального) обследования людей первых из этих 4 возрастных групп наблюдали увеличение процента лиц, в препаратах лимфоцитов которых обнаруживали поврежденные митохондрии (это возрастание составляло 9, 15, 20, 9 % соответственно, в 1-4-й группах). Повреждение митохондрий состояло в их набухании, разрушении крист, образовании миелиноподобных структур и появлении гигантских митохондрий.
В 1985 году было обнаружено, что старение диплоидных фибробластов человека in vitro сопровождается увеличением продукции в них молочной кислоты, обусловленным активацией гликолиза. Причем такая активация предшествует другим биологическим, а также морфологическим изменениям при старении. Поэтому возможно, что усиление гликолиза и увеличение выработки молочной кислоты являются одними из существенных механизмов старения клеток.
Увеличение активности гликолиза, в процессе которого образуется молочная кислота, должно увеличить в цитоплазме или даже в ядре концентрацию водородных ионов. При этом снижение рН в старой клетке может иметь для нее несколько тяжелых последствий. Одним из них является уменьшение стабильности генома. Ведь как мы уже знаем, эта стабильность нарушается вследствие депуринизации ДНК — процесса, катализируемого водородными ионами (следовательно, его скорость резко возрастает с уменьшением рН).
Уменьшение способности мышц старых животных поддерживать энергетический баланс, вероятно, определяется комплексом механизмов как внутриклеточных (уменьшение в мышцах количества митохондрий, интенсивности аэробного ресинтеза АТФ и внемитохондриального фосфорилирования), так и внеклеточных (уменьшение функциональных способностей системы кровоснабжения мышцы). Увеличение содержания лактата в "старых" мышцах обычно объясняют относительным увеличением анаэробного энергообеспечения при нагрузке. Возможно, однако, что в старости лактат и выводится из тканей менее эффективно.
Таким образом, нарушения биоэнергетических процессов при старении, которые мы кратко рассмотрели, связаны не только с изменением энергообеспечения клеток. Они могут приводить, в частности, к нарушению стабильности генома. Но это с одной стороны. С другой — снижение этой стабильности может нарушить регуляцию окислительных процессов.
В своей книге "Радиобиологические эффекты и окружающая среда" (Москва, 1983) автор этих строк описал гипотетическую программу гибели клеток, включаемую по крайней мере в лимфоцитах, если в них равновесие между процессами повреждения и репарации ДНК резко нарушено (например, под влиянием облучения или ингибиторов репарации ДНК). Тогда в клетке резко снизится концентрация никотин-амидадениндинуклеотида (НАД), который используется в процессе синтеза поли(АДФ-рибозы), активируемом в случае образования в ДНК значительного числа повреждений. Но ряд ферментов — НАД-зависимые, поэтому нарушение целостности ДНК, даже вне связи с нарушением ее способности контролировать синтез белков, может приводить к нарушению метаболизма, в том числе биоэнергетических процессов, и в связи с этим — к снижению содержания АТФ в клетке.
В последние годы получены факты, подтверждающие это теоретическое предсказание. Есть также основание полагать, что описанный механизм саморазрушения клеток встроен не только в лимфоцитах, но и в других клетках (например, в нервных), ошибки в работе генетического аппарата которых (а они неизбежны, если ДНК этих клеток сильно повреждена) могут иметь тяжелые последствия для организма (иммунологические нарушения в результате потери лимфоцитами способности различать "свои" и "чужие" белки или нарушение нервной регуляции функций). Поскольку повреждение ДНК клетки увеличивает вероятность ее злокачественной трансформации, то включение рассмотренного механизма клеточной гибели эквивалентно защите организма от потенциально трансформированных делящихся клеток. Таким образом, малигнизация может быть связана с мутацией клетки, приводящей к таким изменениям метаболизма НАД и поли(АДФ-рибозы) или стабильности генома, при которых выключается предполагаемая программа гибели клетки.
Начальные (пусковые) механизмы возрастных изменений биоэнергетических процессов в клетке многообразны. Однако в основном они связаны с нарушением регуляции синтеза и функции ДНК и ферментов, катализирующих эти процессы. Но значение имеют и возрастные изменения мембран, "упорядочивающих" метаболизм. Ведь и окислительное фосфорилирование, и гликолитический путь метаболизма протекают при участии мембранных структур: в первом случае — митохондрий, во втором — эндоплазматического ретикулума.
Проводимый в настоящей главе даже краткий анализ данных об изменении мембран при старении показывает, сколь быстро устанавливалась связь между фундаментальными биологическими исследованиями и изучением механизмов старения в течение последнего десятилетия. Действительно лишь в эти годы были получены основные результаты о свойствах специальных белков-рецепторов, многие из которых встроены в цитоплазматические мембраны. Одни из этих белков воспринимают ("рецептируют") определенные гормоны, другие — белковые факторы роста, а третьи — вещества, участвующие в передаче нервного импульса (нейропередатчики или нейротрансмиттеры, т. е. соединения, благодаря которым возбуждение от одного нейрона передается к другому). Это значит, что регуляция различных функций организма эндокринной и нервной системой осуществляется с участием рецепторов.
Но среди многих биологов и физиологов, изучавших природу старения, уже давно укрепилось мнение о важной роли нейроэндокринных возрастных изменений в старении целостного организма. Вероятно, поэтому почти одновременно с открытием тех или иных рецепторов, как правило, начинали изучать и возрастные изменения этих рецепторов. За прошедшее десятилетие результатов таких исследований опубликовано много не только в биогеронтологической, но и в другой специальной литературе: по мембранологии, нейроэндокринологии, фармакологии, молекулярной кардиологии и т. д. О ряде этих исследований будет рассказано в настоящем разделе главы.
А сейчас одно небольшое пояснение. Дело в том, что, кроме рецепторов, расположенных на поверхности клетки и связывающих нейротрансмиттеры или гормоны, существуют и более глубоко расположенные (цитоплазматические) рецепторы, которые реагируют с относительно легко проникающими через мембрану, например, стероидными половыми гормонами. Затем комплекс рецептор — гормон транспортируется в ядро, где он вызывает активацию определенных генов, следствием чего является индукция синтеза определенных белков, а следовательно, и специфическое изменение метаболизма в определенной ткани — "мишени гормона", имеющей соответствующие рецепторы.
Связывание определенной молекулы (лиганда) с мембранными рецепторами также приводит к "запрограммированным" изменениям: проницаемости мембраны, концентрации циклической аденозинмонофосфорной кислоты (цАМФ) или ионов Са2+ и т. д. Происходит это закономерно, потому что рецепторы встроены в мембрану таким образом, что они находятся в контакте с другими определенными макромолекулами, и в случае связывания рецептора "со своим" лигандом изменяется структура не только рецепторa, но и структура и активность других (но определенных) макромолекул, "чувствительных" к рецептору или к изменению концентрации цАМФ или Са2+. После такого введения продолжим рассказ о роли мембран в старении.
Функция мембран не ограничена лишь их очевидным свойством — регуляцией путем переноса ионов и других низкомолекулярных веществ. В регуляции биосинтеза ДНК и РНК, переносе последней из ядра в цитоплазму существенное значение имеет ядерная мембрана; биосинтез многих белков протекает на полисомах, "организуемых" мембранами эндоплазматической сети; биосинтез липидов регулируется ферментами, упорядоченными на митохондриальных мембранах. Распад же различных биомакромолекул, их гидролиз осуществляются также в определенных мембранных структурах — лизосомах. Именно благодаря тому, что многие гидролазы ограничены, "упрятаны" в этих структурах, обеспечивается относительная надежность функционирования макромолекул в клетке. Таким образом, все основные биохимические процессы в клетке регулируются мембранами, а функции мембран основаны на их способности контролировать и координировать диффузию и активный перенос субстратов (т. е. перенос вещества против градиента концентрации) в клетку и из нее, от одной органеллы к другой, служить площадкой, на которой происходит специфическая ориентация макромолекул и образование между ними специфических комплексов и формирование органелл (например, полисом), воспринимать внеклеточные сигналы с помощью встроенных в мембраны рецепторов, специфически взаимодействующих с определенными (сигнальными) молекулами, благодаря перечисленным свойствам поддерживать и регулировать определенную форму клеток, рост и состояние их митотической активности. Ядерная мембрана "старых" клеток имеет значительно измененную структуру, что хорошо видно в электронном микроскопе: она образует складки и впячивания внутрь ядра, иногда наблюдается нарушение целостности ее структуры. Эти изменения должны нарушить специфичность взаимодействия ядра с цитоплазмой, уменьшить селективность процессов переноса вещества из ядра в цитоплазму и наоборот. Нарушение переноса должно касаться не только низкомолекулярных веществ, но и передвижения (транслокации) в обоих направлениях биомакромолекул (главным образом РНК из ядра в цитоплазму и ядерных белков из цитоплазмы в ядро).
При старении клеток печени изменяется химический состав цитоплазматических мембран, а точнее, изменяется соотношение различных белков и активность ферментов, входящих в их состав.
Мы уже знаем, что нарушение способности к делению — один из важных признаков старения клеток. Молекулярные механизмы этого нарушения могут быть многообразны и, вероятно, так или иначе связаны с изменением структуры и функции генетического аппарата. На основании только что сказанного можно предположить, что другой клеточной структурой, изменение которой может быть критическим для нарушения в процессе старения способности клетки к делению, является цитоплазматическая мембрана.
Так, ухудшение реакции старых клеток на действие митогенных факторов — одна из основных причин снижения их пролиферативной активности и, вероятно, жизнеспособности, Известно также, что фибробласты кожи новорожденных более чувствительны, чем фибробласты взрослых доноров, к стимулирующему рост действию таких факторов роста, как эпидермальный или тромбоцитарный, а также инсулин. Не только фибробласты кожи, но и кератиноциты новорожденных делятся in vitro более интенсивно, чем кератиноциты взрослых людей, и первые более чувствительны, чем вторые, к стимулирующему рост действию фактора роста кератиноцитов и эпидермального фактора роста (ЭФР). Таким образом, есть основание полагать, что снижение пролиферативной активности и фибробластов и кератиноцитов, происходящее при их старении, связано с возрастным снижением реакции этих клеток на факторы роста, присутствующие в среде роста.
В заживлении ран существенное значение, вероятно, имеет также стимуляция деления фибробластов под влиянием ЭФР. Поэтому весьма важны данные Р. Д. Фихлинса с сотрудниками из Вистарского института анатомии и биологии в Филадельфии о том, что при старении in vitro диплоидных фибробластов человека их реактивность, способность к стимуляции синтеза ДНК под влиянием ЭФР снижаются. Исследования рецепторов к этому фактору, выделенных из фибробластов различных пассажей, показали, что при старении клеток эти рецепторы теряли способность фосфорилировать тирозины белков.
Приведенные данные находятся в соответствии с результатами исследований Юкиаки Курода из Национального института генетики Японии. Он обнаружил, что добавление ЭФР к культурам "молодых" фибробластов человека ускоряет их деление, причем начинают делиться даже клетки, ранее переставшие делиться. Но стимулировать деление клеток старых культур путем добавления к ним факторов роста не удалось.
Что касается неделящихся клеток, то особое значение в старении, по-видимому, имеет изменение их мембран в области контактов (синапсов). Известно, что нарушение структуры и функции этих мембран может снижать скорость и точность передачи информации в нервной системе, что наблюдали в процессе старения и животных, и человека. Последний абзац, взятый из первого издания этой книги, теперь также можно продолжить приведением конкретных фактов, подтверждающих сформулированное в нем предположение об особой чувствительности синаптических мембран к старению и свидетельствующих, сколь бурно, развиваются исследования в рассматриваемой области знаний. При сравнении нервных окончаний крыс в возрасте 5–7 или 23–25 месяцев обнаружены существенные различия их синаптических мембран. Авторы этой работы полагают, что в результате таких изменений нарушается не только функция нервных окончаний, но и жизнеспособность самой нервной клетки, так как при этом в ней увеличивается содержание ионизованного кальция, а это может стать причиной возрастной (спонтанной) гибели нейронов. Подобно тому как в нарушении регуляции митотической активности делящихся клеток имеет значение изменение ее рецепторов, так и уменьшение числа или модификация структуры рецепторов нервных клеток может быть одним из определяющих факторов старения этих клеток.
Значительное количество информации получено относительно следующих видов рецепторов нейромедиаторов: β-адренергических, холинергических и дофаминовых. Обнаружено, что при старении уменьшается число рецепторов по крайней мере в некоторых отделах головного мозга человека и грызунов. Уменьшение количества рецепторов нейромедиатора ацетилхолина (холинергических рецепторов) в коре и гиппокампе пожилых людей может быть биологической основой снижения их способности к запоминанию. Следовательно, возрастные изменения рецепторов можно скоррелировать с функциональными нарушениями. Уменьшение рецепторов для нейромедиаторов связывают с утратой синаптических контактов, отростков или нейронов, причем потеря рецепторов может быть как следствием разрушения этих структур, так, возможно, и причиной такого разрушения, поскольку в некоторых медиаторных системах возрастная потеря рецепторов предшествует возрастным анатомическим изменениям.
Уменьшение при старении чувствительности мембран клеток головного мозга к нейромедиаторам также объясняют уменьшением содержания в них соответствующих рецепторов. В частности, значительно снижается количество дофаминовых рецепторов, связанных с аденилатциклазой. Содержание периферических дофаминовых рецепторов такого типа (например, в почечной артерии кроликов) при старении также значительно уменьшается.
В клетках мозга, вероятно, снижено не только число, но и скорость синтеза адренорецепторов. Так, скорость появления новых мест связывания лигандов, взаимодействующих с такими рецепторами, в гипоталамусе и коре мозга 24-месячных крыс значительно меньше, чем в тех же органах 3-месячных животных. Эти данные были получены Луисом Гринбергом с соавторами из отдела фармакологии медицинского колледжа в Пенсильвании и в Институте психиатрии в Филадельфии. А Георг Рот и Джаклин Генри из лаборатории молекулярных и клеточных исследований Балтиморского геронтологического центра (США) обнаружили снижение на 30 % скорости синтеза дофаминовых рецепторов в стриатуме (полосатом теле) головного мозга 24-25-месячных крыс по сравнению с 3-6-месячными.
В Национальном институте старения в Балтиморе были исследованы молекулярные механизмы снижения при старении способности тканей адекватно реагировать на гормоны и нейромедиаторы. Оказалось, что это снижение может быть обусловлено изменением количества и, возможно, структуры и функции определенных рецепторов. Так, в одной из структур головного мозга (полосатом теле) обнаружено снижение количества дофаминовых рецепторов. В гипофизе же снижается число рецепторов к эстрогенам А у рецепторов, расположенных в слюнной железе и специфически реагирующих с катехоламинами, при старении уменьшается эта реакционная способность. Следующие после взаимодействия рецептора со "своим" биологически активным веществом реакции также могут нарушаться при старении. Такое нарушение обнаружено в гипофизе при исследовании реакций, инициируемых взаимодействием эстрогенов со своими рецепторами.
Получены также данные, подтверждающие предположение о том, что снижение способности матки у старых крыс реагировать на воздействие эстрогена является следствием потери рецепторов или ослабления их активности. Таким образом, обнаруживается общая закономерность старения — снижение концентрации рецепторов нейромедиаторов и гормонов (мембранных или находящихся в цитоплазме) в различных клетках. Однако из этого правила имеются исключения. Одно из них обнаружилось при анализе данных работы Малана Кольга с сотрудниками из отдела фармакологии в университете Охио (США). Из такого анализа следует, что мочевой пузырь самцов старых крыс (возраст 29 месяцев) более чувствителен к холинергическим стимулам, и это обусловлено увеличением в клетках мочевого пузыря по сравнению с аналогичными клетками 7-месячных крыс количества мускариновых холинергических рецепторов.
Особенно резкие изменения функции мембран можно наблюдать при старении клеток крови эритроцитов, которые живут в организме недолго (например, в организме человека — несколько месяцев).
В последние годы при исследовании старения и этих клеток обнаружено изменение их рецепторов. Количество инсулиновых рецепторов на эритроцитах определяли радиохимическим методом по связыванию с ними инсулина, меченного йодом-125. Оказалось, что фракция самых молодых клеток содержит наибольшее количество рецепторов. В процессе созревания ретикулоцитов концентрация рецепторов в них уменьшалась очень быстро. По мере же старения зрелых эритроцитов количество рецепторов уменьшалось экспоненциально с полупериодом около 40 дней.
Исходя из термодинамики можно предвидеть спонтанное образование прочных комплексов или даже ковалентных сшивок между мембранными белками, причем такой процесс ускоряется под влиянием перекисей липидов мембран. Поскольку количество последних при старении возрастает, то, вероятно, с возрастом увеличивается и скорость спонтанного "сшивания" мембранных белков, особенно если скорость метаболизма таких белков замедлена. Все это приводит к предположению, что при старении различных клеток в их мембранах, в первую очередь — в мембранах неделящихся клеток, возрастает часть (фракция) высокомолекулярных белков, образуемых в результате сшивания мембранных белков.
А. Бовелли с сотрудниками обнаружили в 1984 году, что в ходе старения эритроцитов на их поверхности появляются ассоциаты белков, скрепленные дисульфидными мостиками и локализованные в мембране. Такие ассоциаты, вероятно, образуются в результате протеолиза и окисления других мембранных или даже цитоплазматических белков. При добавлении к "молодым" эритроцитам АТФ или глутатиона (одного из природных антиоксидантов) в физиологических концентрациях процесс образования в мембране ковалентно сшитых комплексов белков резко ингибируется. Этот факт представляет даже практический интерес. Ведь при хранении крови требуется в максимальной степени сберечь эритроциты, не дать им "постареть". Значит, с этой целью можно попытаться использовать также физиологические концентрации АТФ и(или) глутатиона. Есть основания полагать, что такие вещества окажут благотворное действие и на организм — реципиент донорской крови. Но конечно, эти теоретические предположения должны быть дополнены проверкой их справедливости на различных животных, включая обезьян.
Когда сравнили белки мембранных структур синаптосом коры головного мозга крыс в возрасте 2, 12 и 24 месяцев, то оказалось, что отношение общего количества белка с молекулярной массой, превышающей 5-105, к белкам с массой, меньшей этой величины, у молодых животных составляет 1:3, у взрослых — 1:2,1, у старых — 1:1,3. Относительное увеличение высокомолекулярных фракций белков с возрастом, вероятно, имело существенное значение в снижении функциональных способностей головного мозга, так как центрофеноксин, который по некоторым параметрам тормозит старение мозга и улучшает его функцию у старых животных, будучи введенным старым крысам, "омолаживал" белковый состав мембран синаптосом их головного мозга.
То, что мы сейчас обсуждали, касалось цитоплазматических мембран, отделяющих клетку от окружающей ее внешней среды. Но ведь для нормального функционирования клетки не меньшее значение имеют и мембраны, "пронизывающие" клетку, разделяющие ее на отдельные органеллы, "отсеки" и т. д. Это, в частности, мембраны эндоплазматической сети, на которых происходит синтез многих белков и которые служат стенками каналов, пронизывающих клетку.
С недостаточно активной функцией лизосом связано и накопление в клетках "шлаков", метаболически стабильных комплексов — об их природе и роли в старении будет рассказано позднее.
Теперь рассмотрим физико-химические механизмы старения мембран, знание которых позволит нам глубже понять и биологическую роль самого феномена старения этих структур. Такие механизмы исследовали в основном двумя путями. Один из них состоял в сравнении химического состава высокоочищенных препаратов определенных мембран, выделенных из клеток животных различного возраста.
Таким образом было обнаружено, в частности, что процесс старения изменяет липидный состав митохондриальных мембран. В качестве примера рассмотрим сравнительные данные о жирокислотном составе, содержании холестерина и фосфолипидов в мембранах митохондрий сердца молодых (4 месяца) и старых (33 месяца) крыс-самцов. Оказывается, что в мембранах старых животных значительно увеличено содержание холестерина и процент сфингомиелина и кардиолипина. Среди жирных кислот при этом увеличивалась доля пальмитиновой кислоты, а в кардиолипине — доля длинноцепочечных жирных кислот. При старении у большинства фосфолипидов индекс ненасыщенности уменьшался (у кардиолипина он повышался). Такие изменения мембран должны приводить к изменению их вязкости (точнее, микровязкости), "текучести" митохондриальных мембран, что, в свою очередь, может нарушить способность митохондрий сердца обеспечивать его энергией, а это в конечном счете может приводить к нарушениям сердечной деятельности, наблюдаемым в старческом возрасте.
Понятия "микровязкость" или "текучесть" мембран введены биофизиками, использующими "метки или зонды" — органические молекулы, во-первых, способные флуоресцировать или обладающие парамагнитными свойствами и, во-вторых, способные связываться с липидной или белковой компонентой мембран. В этом случае флуоресцентным методом или методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) можно определить подвижность метки (зонда) при различных температурах, а эта подвижность и ее изменение с изменением температуры по очевидным физическим причинам как раз и определяется подвижностью или микровязкостью тех молекул, к которым пришиты метки (зонды).
С помощью таких методов и было определено, что подвижность ацильных цепей (текучесть липидов) мембран уменьшается при старении клеток. Такие данные были получены, в частности, советскими биофизиками А. Б. Капитановым и В. Г. Ладыгиной во 2-м Медицинском институте. К сходному выводу пришли известные зарубежные исследователи мембран М. Шиницкий и Я. Скорник. Они заключили на основании анализа имеющейся информации по изменению физико-химических свойств мембран при старении, что начальная фаза старения мембран характеризуется существенным изменением состава и физических свойств липидного бислоя, в частности увеличением микровязкости.
В совместной работе В. К. Кольтовер из Института химической физики АН СССР, Р. А. Гуськова из МГУ и автор этих строк методом ЭПР и с помощью спинового зонда, вводимого в липидный бислой мембран микросом, сравнивали физические свойства мембран, выделенных из печени молодых (2–5 месяцев) крыс и старых (22-месячных). Резких возрастных изменений мембран, исследованных при 37 °C, мы не обнаружили. Однако сравнение температурных зависимостей "параметра упорядоченности" спинового зонда в них показывает, что структура мембран в процессе старения все же нарушается. Это нарушение может быть связано с изменением степени метилирования их фосфолипидов. Данные, свидетельствующие об этом, интересны и тем, что они показывают возможность обратить вспять определенные (хотя и не все) процессы старения на молекулярном уровне с помощью физиологически активных веществ.
Так, в стриатуме — одном из участков головного мозга крыс — обнаружено увеличение микровязкости липидов мембран при старении, сопровождаемое снижением включения метальных групп в фосфатидилхолин. Длительное же введение старым крысам S-аденозилметионина, являющегося донором метальных групп, снижало микровязкость мембран стриатума до значений, характерных для мембран молодых животных. Количество β-адренергических специфических участков связывания (рецепторов, количество которых при старении в стриатуме уменьшается) после кормления S-аденозилметионином также возвращалось к норме. Однако активность аденилатциалазы при этом оставалась по-прежнему сниженной.
Приведенные данные позволяют связать только что нами рассмотренные данные об изменении с возрастом физических и химических свойств липидного бислоя мембран с заключением о нарушении в процессе старения рецепторной функции мембран. Ведь молекулы белков-рецепторов встраиваются в липидный бислой и функционируют в его окружении или, может быть, точнее — при его участии. Следовательно, если его химический состав и физические свойства становятся не оптимальными, будут затруднены и включение рецепторов в мембрану (и следовательно, уменьшение их количества, действительно наблюдаемого при старении), и нарушение их функции, особенно регуляции их функции, например, при функциональных нагрузках. Это заключение согласуется с интересными данными об изменении липидного состава плазматических мембран клеток мозга и сердца и активности ферментов, входящих в состав этих мембран, полученными Л. Н. Богацкой с соавторами (Институт геронтологии АМН СССР).
К числу молекулярно-клеточных наиболее четких и хорошо изученных изменений, характеризующих процесс старения, можно отнести накопление в клетках особого пигмента — липофусцина. Увеличение его содержания в клетках различных органов столь симптоматично для старения, что он получил даже название пигмента старения. Точнее, нужно говорить о пигментах-липофусцинах, так как в клетках различных органов (даже в клетках одного типа, но разного возраста) этот пигмент по некоторым свойствам неидентичен. Однако во всех исследованных случаях липофусцины содержат различные (модифицированные) продукты переокисления и полимеризации липидов и липопротеидов.
Можно полагать, что накопление липофусцина при старении снижает функциональный потенциал нервных клеток, а также их способность противостоять вредным воздействиям окружающей среды (таким, как токсины, вирусы, соединения алюминия, попадающие в мозг). Такие внешние воздействия усугубляют "спонтанные" внутриклеточные и сосудистые изменения мозга при старении.
Кроме липофусцина, с возрастом в клетках могут накапливаться и другие молекулы и их комплексы. Результаты исследований, проведенных с использованием предшественников белков и липидов, меченных радиоактивными атомами, приводят к заключению, что часть этих молекул сохраняется в организме в течение промежутков времени, сравнимых с продолжительностью жизни животных. Особенно велика функция медленно обменивающихся белков в мозге, сердце и скелетных мышцах, т. е. в тех органах, специализированные клетки которых не делятся во взрослом организме.
Но ведь условия, существующие даже в нормально метаболизирующих клетках, неизбежно должны приводить к физическому и химическому изменению этих белков: их частичному разрушению теплом, перекисями липидов и т. д., следствием чего должно быть образование ковалентных сшивок между этими белками и другими молекулами клетки. Такие комплексы, подобно липофусцину, очевидно, не могут быть легко удалены из клетки или полностью разрушены, они становятся "шлаками" и постепенно засоряют клетку.
Кроме этого пути образования инертных и в функциональном, и химическом, и термодинамическом отношениях комплексов макромолекул, последние возникают еще и в клетке, а также в результате реакций стабильных и обменивающихся макромолекул с низкомолекулярными веществами, образующими перекрестные связи. Такие агенты обладают несколькими реакционноспособными центрами и поэтому могут реагировать с несколькими макромолекулами. В результате между ними образуются сшивки. Этот процесс аналогичен вулканизации каучука, когда добавление к нему соединений, содержащих серу, приводит к сшиванию молекул каучука между собой и его затвердению. Вещества же, которые могут осуществлять перекрестное связывание макромолекул, возникают в клетке постоянно: это и промежуточные продукты окисления, и металлы и т. д.
Последствия образования инертных комплексов в клетке отнюдь не исчерпываются тем, что такие комплексы мешают распределению веществ в клетке, засоряют ее. Если эти комплексы возникнут в геноме, если образуются перекрестные связи между геном и белком, то функция гена будет частично или полностью нарушена. И может быть, часть сшивок необратима, поскольку сшивки ДНК — белок являются труднорепарируемыми генетическими изменениями. Но известно, что образование даже одной ковалентной связи между белком и уникальным геном может существенно нарушить жизнедеятельность клетки. Следовательно, такие повреждения могут быть по крайней мере одним из важных звеньев молекулярного механизма или, точнее, механизмов старения.
Уже есть основания и для более точной характеристики этих повреждений. В частности, факты и теоретические соображения позволяют считать, что в образовании сшивок с ДНК принимают участие медленно обменивающиеся основные ядерные белки — гистоны, прежде всего те, которые содержат большое количество лизина (аминогруппы этой аминокислоты относительно легко образуют перекрестные связи). До сих пор мы рассматривали механизмы образования и роль в старении и гибели клеток накопления в них относительно стабильных комплексов макромолекул. Но в состав тканей, кроме клеток, входит и межклеточное вещество, роль которого не только механическая. Оно участвует в транспорте различных веществ между клетками, а также между ними и кровью или другими тканевыми жидкостями. Основной компонент межклеточного вещества — коллаген, количество которого с возрастом увеличивается. Таким образом, в процессе старения в организме становится относительно меньше клеток и больше межклеточного вещества. При этом коллаген со временем подвергается и качественным изменениям. Их возникновение определяется и тем, что коллаген — еще одна (кроме ДНК) макромолекула, практически полностью не обновляющаяся после завершения синтеза. И именно эти макромолекулы (и только они!) состоят из цепей, спирально закрученных друг на друга. Правда, ДНК — это двуцепочечная спираль, коллаген — трицепочечная.
Коллаген, выделенный из различных органов старых животных, существенно отличается от выделенного из тех же органов молодых. Эти возрастные изменения разнообразны, однако большинство из них являются следствием одних и тех же молекулярных событий — образования между цепями коллагена ковалентных сшивок, например, между их аминокислотами — лизином и тирозином. Из биохимических изменений коллагена при старении наиболее общими для всех млекопитающих теперь считают следующие: увеличение в нем содержания оксипролина и оксилизина (и соответственно уменьшение содержания пролина и лизина); увеличение скорости неэнзиматического гликозилирования, несмотря на уменьшение скорости общего метаболизма молекул коллагена.
С такими изменениями, вероятно, связаны и функциональные, и структурные изменения коллагена, в частности понижение эластичности его волокон при старении. Первичные молекулярные механизмы этих изменений могут быть различными и включают как процессы, протекающие в межклеточном веществе (уменьшение в нем содержания Н2О, изменение содержания в коллагене других молекул, определяющих правильное расположение молекул коллагена), так и изменения на уровне клеток соединительной ткани (уменьшение их количества, изменение иммунологического статуса при старении).
Наряду со специфическими существуют общие молекулярные механизмы старения клеток и межклеточного вещества, т. е. механизмы, осуществляющие деструкцию организма на различных его уровнях. К числу таких механизмов в первую очередь нужно отнести образование свободных радикалов, Н2О2 и перекисей органических соединений.
Следовательно, известные факты ускорения старения коллагена кожи у экспериментальных животных, облученных ионизирующей радиацией, также, скорее всего, связаны с действием на него активных форм кислорода и перекисей липидов или со снижением антиоксидантной системы защиты от них. Ведь такие изменения действительно наблюдают в облученных клетках тканей, и они ответственны за многие радиобиологические эффекты.
Таким образом, основные принципы старения клеток и межклеточного вещества оказываются одинаковыми. В обоих случаях они обусловлены образованием сшивок между макромолекулами, как правило, не подверженных метаболизму. Причем механизмы сшивания макромолекул также аналогичны. Процесс обычно начинается (инициируется) истинно спонтанным, тепловым разрушением макромолекул или окислением их низкомолекулярными метаболитами (в основном активными формами кислорода и перекисями). Вероятно, в механизм сшивки различных макромолекул (ДНК и гистонов; молекул коллагена, макромолекул, входящих в состав эластина) существенный вклад вносят реакции с участием аминогрупп аминокислоты лизина.
Глава IV
Молекуляpнo-клеточные системы поддержания жизнеспособности
Таким образом, если продолжать аналогию клетки с биохимической фабрикой, то нельзя не увидеть одну существенную отличительную особенность: программа работы этой фабрики постоянно разрушается продуктами ее собственного производства. И нормально функционировать такая фабрика (например, в течение сроков, сопоставимых со временем, затрачиваемым на ее создание) может лишь в том случае, если в ней имеются "сверхпрограмма" и средства восстановления всех программ работы фабрики.
В клетке действительно имеются механизмы и даже системы механизмов для ремонта поврежденных генетических структур. Схема работы наиболее изученного — эксцизионного механизма репарации представлена на рис. 6. Один из интереснейших механизмов репарации ДНК, открытых в последние годы, — устранение из ДНК гуанинов, алкилированных по 6-му кислородному атому. Особенность этой системы репарации ДНК состоит в ее адаптивности, т. е. ее активность во многих клетках увеличивается в условиях, когда возрастает число повреждений, устраняемых ею. Поскольку такие повреждения с относительно большой частотой приводят к мутации и трансформации клеток, то рассматриваемую систему репарации ДНК считают антимутагенной и антиканцерогенной. В процессе такой репарации "лишняя" метильная группа гуанина двойной спирали ДНК переносится на цистеиновый остаток фермента — акцепторного белка. Происходит полное восстановление исходной структуры остатка гуанина в ДНК, но сам фермент инактивируется (см. также с. 203).
В начале 80-х годов автор этих строк теоретически предсказал, что образование О6-метилгуанина в ДНК может происходить вследствие реакции ДНК с нормальным метаболитом, необходимым всем клеткам для осуществления различных физиологических функций — S-аденозилметионином. Иными словами, определенное количество повреждений ДНК рассматриваемого типа неизбежно образуется и при физиологических условиях. С этим обстоятельством, вероятно, и связана способность клеток развивать реакцию, так сказать, самоадаптации (т. е. реакцию защиты ДНК от спонтанного физиологического повреждения ДНК "своими" необходимыми клетке метаболитами).
О роли функции рассматриваемого фермента в жизнестойкости и долголетии млекопитающих свидетельствует, например, следующее. Исходный уровень его активности сначала был изучен в печени крыс А. Е. Пегом из отдела физиологии и исследований рака Пенсильванского университета (США). А пять лет спустя советскими онкологами (А. Я. Лихачевым и другими из НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова Минздрава СССР) были опубликованы данные об активности этого фермента в печени человека. Сопоставление данных этих различных работ показывает, что способность устранить премутагенные и преканцерогенные повреждения ДНК, индуцируемые алкилирующими нитрозаминами, в клетках человека примерно в 10 раз больше соответствующей способности клеток печени крыс.
Рассмотренными процессами репарации ДНК и катализируемыми ими ферментами не исчерпывается регуляция на самом Деле гораздо более сложных механизмов залечивания генетических ферментов. В частности, в таких механизмах принимают участие и ферменты, изменяющие структуру ДНК на уровнях ее организации, более высоких, чем первичная. Один из этих ферментов — топоизомераза, название которого подчеркивает и его предназначение — менять топологические свойства ДНК.
Топоизомераза — очень важный фермент, нужный клетке не только для репарации ДНК, но и для регуляции других функций генетического вещества, включая редупликацию генов и их транскрипцию. (Роль такого рода ферментов в репарации ДНК и изменение их активности в процессе канцерогенеза были предсказаны в СССР еще в начале 70-х годов). Но особенно интересны данные, полученные в экспериментах с культивируемыми клетками человека.
Так вот, когда сравнили топоизомеразы в клетках здоровых доноров и больных анемией Фанкони (у последних увеличена нестабильность хромосом, снижена продолжительность жизни и имеются некоторые симптомы преждевременного старения, включая такой грозный, как увеличенная предрасположенность к опухолевым заболеваниям), то оказалось: при этой болезни резко изменено внутриклеточное распределение рассматриваемого фермента. В клетках здоровых людей фермент сосредоточен в основном в их ядрах, а в клетках больных людей активность топоизомеразы в ядрах мала, но она велика в цитоплазме. Возможно, это связано с тем, что вследствие мутации того или иного гена (в частности, гена, кодирующего самую топоизомеразу), фермент, будучи синтезированным в цитоплазме, затем не может быть доставлен в ядро. Так полагают авторы, обнаружившие различия в распределении топоизомеразы между клетками здоровых и больных анемией Фанкони людей.
Но более вероятным кажется другое объяснение этого различия. В клетках больных анемией Фанкони увеличена выработка супероксидного радикала и(или) генерируемого с его участием Н2О2, а это и приводит к увеличенной нестабильности хромосом. Об этом свидетельствует, в частности, тот факт, что при добавлении в среду роста клеток этих больных супероксиддисмутазы или каталазы частота спонтанных и индуцированных хромосомных аберраций "нормализуется". В связи с такими изменениями метаболизма, очевидно, и нарушается распределение топоизомераз. Но этот фермент, как считают исследователи, причастен к точности репарации ДНК и к подготовке ДНК к редупликации, и снижение его активности, вероятно, приводит к нарушению обоих процессов.
Действительно уже относительно давно было установлено, что процесс репликации ДНК в клетках больных с нестабильностью хромосом изменен. А в последние годы обнаружена и еще одна особенность этого процесса в таких клетках: радиочувствительность синтеза ДНК в них значительно снижена. Так, если уже при относительно небольших дозах облучения (меньших, чем летальные) в нормальных клетках синтез ДНК резко тормозится, то в клетках больных с синдромом нестабильности ДНК этого не наблюдается. Но ведь облучение индуцирует в ДНК различные повреждения, которые в норме должны быть залечены, причем точность (завершенность) этого процесса проверяется с помощью топоизомераз. Лишь после этого, наверное, начинается синтез ДНК. С такими процессами, вероятно, и связана задержка синтеза ДНК в облученных клетках.
Но при снижении активности топоизомераз и наличии каких-то других дефектов в механизмах репарации и репликации ДНК клетками "тратится" меньше времени на контролирующие целостность ДНК процессы.
Таким образом, исходя из предположения об участии топоизомеразы в проверке точности (или правильнее — полноты) репарации спонтанных и радиационных повреждений ДНК можно объяснить различные молекулярно-генетические особенности клеток больных с нестабильностью хромосом.
Теперь вопрос можно поставить шире: не является ли нарушение структуры, синтеза или распределения топоизомеразы одним из молекулярных механизмов преждевременного старения? И не являются ли возрастные изменения репликации ДНК средством такого нарушения? Дефект репликации ДНК наблюдали в фибробластах людей, страдающих синдромом Вернера или прогерией взрослых (одно из генетически детерминированных заболеваний, обозначаемых и как синдром преждевременного старения). Этот факт свидетельствует о том, что ответ на оба вопроса, наверное, должен быть положительным.
Но как же изменяется способность клеток к репарации ДНК в процессе нормального, физиологического старения? В обширной литературе на рассматриваемую нами тему очень мало работ, освещающих исследования, в которых проблему возрастных изменений репарации ДНК изучали бы на клетках человека, стареющих не in vitro, a in vivo. Хотя "модель" можно исследовать подробнее и с меньшими усилиями, чем само явление, но все же интересно знать, как происходит старение клеток в естественных условиях.
Прежде всего приведу доказательство уменьшения способности к репарации однонитевых разрывов ДНК у фибробластов взрослых людей по сравнению с эмбриональными фибр об ластами. Способность к репарации ДНК эмбриональных диплоидных фибробластов медицинских абортусов и фибробластов, полученных из кожных биопсий здоровых доноров в возрасте от 25 лет до 91 года, А. Н. Хохлов и автор этих строк (работа выполнялась при поддержке Г. Д. Бердышева из КГУ и К. Н. Гринберга из Института медицинской генетики АМН СССР) определяли методом седиментации в градиенте щелочной сахарозы, о котором я уже рассказывал. Результаты, полученные при использовании этой методики, интерпретируются достаточно определенно: повреждение ДНК (радиацией или химическими мутагенами), приводящее к замедлению скорости седиментации ДНК, означает накопление в ней разрывов или других модификаций (щелочно-лабильных связей), которые в щелочной сахарозе трансформируются в разрывы ДНК. Ускорение седиментации ДНК поврежденных клеток в процессе их инкубации при 37 °C интерпретируется как показатель способности клеток устранять повреждения ДНК: в основном однонитевые разрывы и щелочно-лабильные связи.
При отработке условий эксперимента (количество наносимых на градиент клеток, продолжительность их лизиса, скорость центрифугирования) были исключены все возможные артефакты метода. Это позволило максимально увеличить воспроизводимость результатов и установить, что хотя сразу после облучения седиментаграммы ДНК эмбриональных и "взрослых" фибробластов практически одинаковы, в процессе инкубации скорость седиментации ДНК в эмбриональных клетках возрастает несколько быстрее.
Анализ данных многих серий опытов по сравнительному исследованию ДНК эмбриональных и "взрослых" фибробластов при 37 °C показывает, что и за 30 минут, и за 1 час инкубации облученных "взрослых" клеток в их ДНК устраняется; меньше повреждений, чем за тот же промежуток времени в ДНК эмбриональных клеток,
Ранее другими авторами был проведен целый ряд исследований, посвященных изучению изменений способности к репарации различных повреждений ДНК при "старении" in vitro культивируемых диплоидных фибробластов. Эти данные показывают, что репарация индуцированных радиацией однонитевых разрывов и щелочно-лабильных связей нарушается лишь в клетках последних пассажей, когда их жизнеспособность значительно снижена и большая часть клеток в популяции теряет способность к делению.
Другой подход, использованный нами для изучения возрастных изменений репарации ДНК, состоял в сравнении интенсивностей репаративного синтеза ДНК в клетках животных (крыс) различного возраста и в фибробластах человека, культивируемых в течение длительного времени. О результатах, полученных при исследовании спонтанного репаративного синтеза ДНК в клетках головного мозга, было рассказано в предыдущей главе. То были результаты исследования интактных животных.
Но кроме того, в клетках головного мозга взрослых крыс была обнаружена способность к внеплановому синтезу ДНК, индуцированному (вероятно, репаративному) гамма-излучением. Однако когда такие же опыты были поставлены нами на 23-26-месячных крысах, то у них индуцированного излучением внепланового синтеза ДНК обнаружить не удалось. Таким образом, пока мы имеем доказательство способности к обоим репаративным синтезам ДНК — спонтанному и индуцированному — только в нервных клетках головного мозга молодых животных.
Кстати, наличие такой способности заставляет с осторожностью относиться к широко разрекламированным, сенсационным результатам исследований Д. Пейтона и Ф. Нотебома из Рокфеллеровского университета, наблюдавших обмен ДНК в нервных клетках головного мозга взрослых животных (они исследовали канареек) и на основании такого обмена заключивших, что нервные клетки могут разрушаться и замещаться в процессе деления оставшихся. Возможно, однако, что обмен ДНК, исследованный американскими авторами, был обусловлен репаративным синтезом ДНК.
Чтобы выяснить, изменяется ли в процессе старения клеток человека их способность к репарации повреждений ДНК, диплоидные клетки, совершившие различное число делений in vitro, облучали УФ-светом и определяли интенсивность протекающего у них синтеза ДНК, связанного с репарацией повреждений ДНК. Доказательством включения тимидина как следствия внепланового (репаративного) синтеза ДНК являлся, в частности, тот факт, что его интенсивность определялась величиной дозы УФ-облучения. При облучении клеток в относительно небольшой дозе — 25 эрг/мм2 интенсивность репаративного синтеза ДНК в "старых" клетках (40-го пассажа) была статистически достоверно меньше интенсивности репаративного синтеза ДНК в "молодых" клетках (26-го пассажа).
Но конечно, данные, полученные в опытах с клетками, стареющими in vitro, надо осторожно экстраполировать на ситуацию в организме. Поэтому больший интерес представляет вопрос о том, как изменяется репаративный синтез при старении клеток организма. Поскольку, как будет объяснено ниже, это важный для понимания механизмов старения и долголетия вопрос, то основные из имеющихся на этот счет фактов, опубликованных в последние годы (1984–1985), мы теперь рассмотрим.
Е. Ковакс с соавторами из лаборатории генетики человека в Базеле изучили спонтанный и индуцированный УФ-излучением репаративный синтез в лимфоцитах 38 мужчин и 17 женщин, которые были разделены на две группы: 17–39 лет и 44–74 года. Они установили, что интенсивность спонтанного репаративного синтеза ДНК в лимфоцитах людей 1-й группы была меньше, чем в лимфоцитах 2-й. Однако значительных различий в интенсивности индуцированного репаративного синтеза ДНК они не обнаружили, хотя и отметили, что клетки молодых людей менее гетерогенны по этому показателю.
А группа исследователей из Колумбийского университета в Нью-Йорке исследовала интенсивность репаративного синтеза ДНК клеток эпидермиса, полученных от людей различного возраста. Эту интенсивность оценивали методом радиоавтографии в клетках, облученных УФ-лучами. Было обнаружено, что активность процесса репарации ДНК по мере увеличения возраста доноров уменьшается на 50 %, причем с возрастом увеличивается доля клеток с низкой интенсивностью репаративного синтеза.
Наблюдаемые изменения нельзя объяснить ни нарушением проницаемости клеток для предшественников ДНК, ни изменением размера ядра. Приведенные данные однозначно свидетельствуют о нарушении с возрастом функции самих систем репарации ДНК.
Ряд исследований был выполнен с клетками, полученными от грызунов. В частности, ученые из медицинского колледжа Питтсбургского университета (США) установили: процесс репаративного синтеза ДНК после облучения УФ-светом клеток печени (гепатоцитов) 2-3-месячных крыс протекает активнее, чем в тех же клетках старых (16–20 месяцев) крыс.
По данным Ганса Ниедермуля с соавторами, способность к эксцизионной репарации клеток крыс в процессе их старения уменьшается. Она была снижена в клетках почти всех исследованных органов 28-месячных крыс по сравнению с клетками 9- и 18-месячных независимо от того, чем вызывали повреждения ДНК: 4-нитрозметилмочевиной, метил-метансульфонатом, 4-нитрохинолин-1-оксидом или гамма-излучением.
Я перечислил все исследованные факторы, не только чтобы подчеркнуть общие закономерности, но и отметить, что все эти факторы являются канцерогенными или потенциально канцерогенными. Это обстоятельство мы учтем ниже при рассмотрении вопроса о причинах резкого учащения в процессе старения животных и человека случаев развития у них злокачественных новообразований.
Поделиться книгой: