Биохимия старения

Гистоны синтезируются в S-фазе клеточного цикла. Это обстоятельство помогло выделить мРНК гистонов из быстро делящихся эмбрионов для идентификации и локализации генов гистонов путем молекулярной гибридизации и клонирования [39, 51, 187, 373]. На ранней стадии дробления эмбриона морского ежа гистоны составляют 25–30 % вновь синтезируемых белков, а мРНК гистонов — почти 70 % всех мРНК. Кроме того, мРНК гистонов гибридизуются с ДНК в несколько сотен раз быстрее, чем многие другие мРНК. Это указывает на наличие большого числа копий генов гистонов. При исследовании шести видов морских ежей было показано, что гены гистонов повторяются в гаплоидном геноме 300-1000 раз. У Drosophila, Xenopus, человека и цыплят повторяемость составляет 100, 10–20, 10–20 и 10 раз соответственно. Такие большие различия в количестве этих генов могут быть связаны с тем, что гистоны необходимы на ранней стадии дробления. Яйца Xenopus содержат большое количество материнских гистонов, тогда как в яйцах морского ежа их очень мало. По-видимому, в первом случае у клеток нет необходимости синтезировать на ранней стадии быстрого деления большое число гистонов. Во втором случае нужно быстро синтезировать гистоны, чтобы не отставать от темпа быстрого деления клеток, и большое количество генов способствует этому.

В исследованиях на Drosophila показано, что гены гистонов расположены в хромосоме II. Пять структурных генов пяти гистонов богаты парами G-C и тандемно повторяются. Они разделены участками, богатыми парами А-Т, которые не транслируются. Вся область кодирования генов гистона содержит 6000–7000 пар оснований ДНК. Ниже показаны расположение и длина генов в яйце морского ежа вместе со спейсерными участками (S) [39].

Структурные гены гистонов не содержат интронов, или нетранслируемых областей, как гены глобина, яичного альбумина и иммуноглобулина, а также не транскрибируются как более длинные предшественники РНК [312]. Спейсерные области не имеют небольших повторяющихся последовательностей оснований, как это наблюдается у генов рРНК и 5S-PHK. У всех видов морских ежей порядок расположения и направления транскрипции гистоновых генов одинаковы, тогда как у разных видов Drosophila они различны [230]:

Синтез и обновление гистонов

Гены гистонов транскрибируются в направлении 5′→3′ с помощью РНК-полимеразы II, так как процесс транскрипции чувствителен к α-аманитину [225]. По-видимому, мРНК пяти гистонов транскрибируются отдельно, а не как единая полицистронная мРНК [205]. Они имеют коэффициент седиментации приблизительно 9S и могут быть разделены в полиакриламидном геле [187]. На 3′-конце мРНК гистонов нет полиадениловой кислоты [5], а на их 5′-конце присутствуют последовательности m7G(5′)pppNm или m7G(5′)pppNmpN [260].

Синтез гистонов тесно связан с синтезом ДНК. мРНК гистонов синтезируются в начале S-фазы, а затем переходят в цитоплазму, где они соединяются с рибосомами для синтеза гистонов [293, 303, 310, 331]. мРНК гистонов существуют приблизительно столько же времени, сколько длится S-период, т. е. 10–12 ч. Есть сообщение, что для транскрипции мРНК гистонов необходимы фосфорилированные НГБ [194], но оно требует подтверждения.

Если синтез ДНК затормозить с помощью цитозинарабинозида или оксимочевины, то синтез мРНК гистонов также прекращается, уже образовавшиеся мРНК разрушаются и синтез гистонов останавливается. Как только это происходит, прекращается также синтез ДНК [188, 366, 379]. Таким образом, клетка обладает механизмом, "включающим" и "выключающим" гены гистонов в соответствии с синтезом ДНК. Стехиометрическое соотношение синтезированных гистонов Н1:Н2А:Н2В:Н3:Н4 равно 0,5:1:1:1:1. Это свидетельствует о том, что четыре гена нуклеосомных гистонов транскрипционно связаны, и их трансскрипция, вероятно, скоординирована. По-видимому, матрица для гистона Н1 не связана с другими генами, поскольку количество синтезированного гистона Н1 составляет только половину количества других гистонов. У Drosophila, расположение гистоновых генов у которой отличается от расположения генов у морского ежа, ген гистона Н1 отделен от гена гистона Н3 1200 парами оснований ДНК. Следовательно, он может иметь самостоятельный промотор [230]. Более того, синтез гистона Н1 в фазе G₁ в три раза интенсивнее синтеза других гистонов [343].

Известно несколько исключений из общего правила сопряжения синтеза гистонов с синтезом ДНК. Например, у лягушки Xenopus laevis при эмбриогенезе не наблюдается упомянутой синхронности на ранних стадиях дробления [3]. В зародышах Vicia faba гистоны появляются в фазах G₁ и S [123]. На ранних стадиях эмбриогенеза морского ежа синтез гистонов начинается в фазе G₁ и продолжается до фазы G₂. Однако в начале дифференцировки их синтез становится синхронным с синтезом ДНК [17]. Обусловлена ли эта синхронизация каким-либо фактором, появляющимся на стадии дифференцировки, неизвестно. В клетках HeLa мРНК гистонов транскрибируется в течение всего клеточного цикла, но их трансляция происходит только в S-фазе [250]. Таким образом, в клетках HeLa с синтезом ДНК координирована трансляция, а не транскрипция. Очевидно, синтез гистонов регулируется на двух этапах — трансляции и транскрипции — с помощью двух разных сигналов. Поскольку молекулы мРНК гистонов малы, их трансляция происходит на дирибосомах. После синтеза гистоны переходят из цитоплазмы в ядро [366].

Судьба четырех нуклеосомных гистонов в процессе деления клетки изучалась с помощью 3Н-лизина и других меченых аминокислот [220]. На примере культуры in vitro миобластов цыпленка показано, что, когда клетка делится, уже существовавшие нуклеосомные гистоны остаются в одной из дочерних клеток, а вновь синтезированные гистоны переходят в другую клетку. Таким образом, новые гистоны, по-видимому, не смешиваются со старыми, и какое-то время их состав сохраняется неизменным. Последовательно синтезирующиеся нуклеосомы располагаются в основном рядом друг с другом. Более того, гистоны в них существуют в неизменном виде в течение трех-четырех поколений. Каким образом это достигается, неизвестно. По-видимому, существует механизм, с помощью которого дифференцированное состояние материнской клетки может передаваться дочерним. В работе с использованием 3Н-аргинина и 125I-иоддезоксиуридина в культуральной среде, содержащей клетки мыши [153], было показано, что нуклеосомные гистоны сохраняются в течение многих поколений. Этот факт очень важен, так как ново-синтезированные гистоны связаны с новообразованной ДНК [353]. Высказано предположение, что некоторые НГБ также сохраняются в процессе деления клетки [122]. Такая консервация нуклеосом и НГБ вместе с последующей транскрипционной специфичностью может служить тем механизмом, с помощью которого достигается и сохраняется дифференцировка клетки. Гистон Н1, однако, в течение одного клеточного поколения обновляется на 15 % [141]. Кроме того, он интенсивно фосфорилируется в конце фазы G₂ клеточного цикла, что совпадает по времени с конденсацией хромосомы [48]. Быть может, фосфорилирование является пусковым механизмом митоза.

Структура хроматина

Химический состав хроматина был установлен несколько лет назад. Однако функции его составных частей, способ их организации, механизм конденсации хроматина во время митоза и последующего разрыхления, способ, с помощью которого происходит экспрессия определенных генов в клетках какого-либо типа и репрессия в других, механизм экспрессии генов в определенные периоды жизни и их репрессии в другое время стали проясняться лишь недавно. Для того чтобы понять механизм экспрессии генов и способы его регулирования, необходимо знать структуру и организацию хроматина.

Тщательные биохимические и биофизические исследования с использованием электронной микроскопии, начатые в 1973 г., позволили установить структуру и функции хроматина. Когда хроматин тимуса теленка гидролизовали ДНКазой, появлялись частицы размером 200 пар оснований или кратным ему [157]. Это свидетельствует о том, что хроматин имеет повторяющиеся участки. Олинс и Олинс [272] выдерживали интерфазные ядра тимуса и печени крысы и эритроциты цыпленка в гипотонической среде и изучали их под электронным микроскопом после соответствующего окрашивания. Хроматин выглядел как цепочка бусинок диаметром 7 нм, связанных друг с другом тяжами ДНК диаметром 1,5 нм (рис. 2.2). Одновременно было показано [163], что при расщеплении хроматина микрококковой или стафилококковой нуклеазами, которые разрывают обе цепи ДНК, образуются частицы диаметром 7 нм, содержащие 200 пар оснований. В работе с использованием биохимических методов и дифракции рентгеновских лучей [200] также установлено, что частицы, получаемые в процессе расщепления нуклеазой, содержат 200 пар оснований ДНК; это составляет почти 85 % общего содержания ДНК в хроматине. Каждая из этих частиц содержит по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4, образующих октамер. Таким образом, эти частицы, позднее названные нуклеосомами [139], содержат восемь молекул гистонов и 200 пар оснований ДНК. Показано также [139], что при соединении гистонов четырех типов и ДНК появляются частицы, похожие на те, которые образуются из хроматина после расщепления нуклеазой. Гросс-Беллард и Шамбон ([139] высказали предположение, что центральную роль в формировании нуклеосомы играют богатые аргинином гистоны Н3 и Н4. Гистон Н1 отсутствует в этих частицах, он расположен между нуклеосомами.

Рис. 2.2. А. Электронная микрофотография хроматина из Oncopeltus fasciatus. В областях, свободных от волокон рибонуклеопротеида, виден хроматин в виде бусин; × 67000 [120]. Б. Схематическое изображение структуры хроматина

На основе описанных выше исследований было высказано предположение [198], что основная структура хроматина состоит из повторяющихся частей, содержащих октамеры гистонов четырех типов и 200 пар оснований ДНК. Во всех изученных до сих пор организмах соотношение количества ДНК и гистонов равно приблизительно 1 и везде имеются повторяющиеся участки октамеров гистонов, связанных приблизительно с 200 парами оснований ДНК, которые образуют линейную цепь нуклеосом диаметром 10 нм. Количество ДНК в нуклеосомах различных органов и организмов варьирует от 140 до 240 пар оснований [116]. Межнуклеосомная, или линкерная, ДНК более чувствительна к микрококковой нуклеазе, а нуклеосомная ДНК — к панкреатической ДНКазе I. Микрококковая нуклеаза и ДНКаза I и II расщепляют находящуюся внутри нуклеосомы нуклеосомную ДНК (или ДНК сердцевины), образуя фрагменты ДНК длиной 10 пар оснований или кратные им, но разрывают ее в разных местах [329]. Когда нуклеосомы из разных тканей и организмов расщепляют микрококковой нуклеазой, чтобы удалить линкерную ДНК, получают стабильные нуклеосомы с мол. массой 200000 и коэффициентом седиментации 11S, содержащие октамер гистонов и ДНК длиной 140 пар оснований [328]. Таким образом, размер ДНК, входящей в состав нуклеосомы, у всех организмов одинаков. Длина межнуклеосомной, или спейсерной, области, которая разделяет соседние нуклеосомы, зависит от функционального состояния хроматина. Транскрипционно активный хроматин имеет укороченную спейсерную область [225, 262].

При определении местоположения гистонов и ДНК в нуклеосомных мономерах хроматина тимуса теленка с помощью метода ЯМР было показано, что радиусы вращения ДНК и белка составляют 5 и 3 нм соответственно. Это свидетельствует о том, что ДНК расположена вне гистоновой сердцевины [21]. Внутренняя белковая сердцевина нуклеосомы имеет диаметр 6,4 нм; она окружена оболочкой из ДНК толщиной 2 нм, так что общий диаметр нуклеосомы составляет 10,4 нм. Эти данные были подтверждены иммунологическими исследованиями. Ни одна из сывороток против четырех гистонов, кроме анти-Н2В, не реагирует с нуклеосомой [2]. Это доказывает, что только гистон Н2В взаимодействует со своим антителом.

В растворе гистоны разных типов связываются попарно [94], причем наиболее сильная связь наблюдается между гистонами Н3 и Н4. Нуклеосома имеет ось симметрии второго порядка. В детальных рентгеноструктурных и электронно-микроскопических исследованиях кристаллических препаратов нуклеосом [117] показано, что сердцевина нуклеосомы представляет собой плоский клинообразный диск размером 5,7×11×11 нм. Полагают [117], что 140 пар оснований ДНК составляют 1,75 витка спирали, диаметр витка равен 9 нм, а его шаг — 2,8 нм (рис. 2.3). Это соответствует приблизительно 80 парам оснований на сверхспиральный виток В-формы ДНК. Гистоны частично погружены в большую бороздку ДНК, а малая бороздка остается открытой. Брем [50] считает, что сердцевина нуклеосомы имеет клинообразную форму, ее размеры 5,5×10×12 нм, а 140 пар оснований ДНК расположены в виде витка. Длина 140 пар оснований ДНК в 6–7 раз превышает размеры нуклеосомной сердцевины. Таким образом, ДНК конденсирована в 6–7 раз, что обусловлено ее связыванием с основными участками цепей восьми молекул гистонов и закручиванием вокруг сердцевины сверхспирали [337]. Это обеспечивает защиту нуклеосомной ДНК от микрококковой и стафилококковой ДНКаз. Однако панкреатическая ДНКаза I расщепляет эту ДНК с образованием фрагментов, состоящих из десяти нуклеотидов. Из-за спиральной структуры ДНК разные участки ее цепи отличаются друг от друга по чувствительности к ДНКазе I [238]. По-видимому, внутри нуклеосомы имеются отдельные центры, по которым происходит расщепление под действием ДНКазы. ДНКаза II расщепляет нуклеосомную ДНК с образованием двух фрагментов по 100 пар оснований [15]. С помощью гидродинамических методов показано [135], что нуклеосома претерпевает два конформационных перехода, зависящих от концентрации соли. Это служит дополнительным доказательством того, что нуклеосома включает две субчастицы, или половины.

Рис. 2.3. Предполагаемое закручивание суперспирали ДНК вокруг сердцевины нуклеосомы. Отмечены места расщепления ДНК нуклеазой [117]

Сердцевина нуклеосомы содержит по две молекулы каждого из Н2А-, Н2В-, Н3- и Н4-гистонов, которые образуют октамер. Положительно заряженные вытянутые цепи этих гистонов электростатически связаны с отрицательно заряженной ДНК. Полагают, что четыре гистона расположены относительно ДНК следующим образом:

Два гистона, Н3 и Н4, богатые аргинином, вероятно, взаимодействуют с двумя концами фрагмента ДНК. Когда эти гистоны добавляют к двухцепочечной ДНК, они образуют характерную структуру типа бублика, видимую в электронный микроскоп [129]. При воссоединении гистонов сердцевины со 140 парами оснований ДНК образуются частицы, имеющие тот же самый коэффициент седиментации, что и нуклеосомы, полученные из хроматина [36, 345]. Было также показано, что одни гистоны Н3 и Н4 образуют с ДНК структуры, похожие на сердцевины нуклеосом, устойчивые к трипсину [64, 327] и дающие картину дифракции рентгеновских лучей, похожую на картину для нативных нуклеосом [261]. Когда гистоны Н3 и Н4 добавляют к ДНК, они связываются со 140 парами оснований ДНК, которая имеет 1,5 сверхспиральных оборота вокруг тетрамера [195]. Образующаяся структура представляет собой цилиндр с размерами 45×8×8 нм. При последующем добавлении гистонов Н2А и Н2В цилиндр сжимается и становится похожим на нативную нуклеосому. Аналогичные явления наблюдал Картер [70]. Это согласуется с высказанным ранее [198] предположением, что гистоны Н3 и Н4 играют существенную роль в образовании структуры нуклеосомы. Эти два гистона наиболее консервативны, содержат большое количество β-структур и взаимодействуют друг с другом сильнее, чем с другими гистонами. По степени связывания с ДНК гистоны располагаются в следующем порядке: Н3 и Н4>Н2А>Н2В>Н1 [283]. При изучении поперечных сшивок показано, что связаны следующие пары: Н3-Н4, Н2А-Н2В и Н2В-Н4 [84].

Согласно одной из точек зрения, сначала 2 молекулы гистона Н3 и 2 молекулы гистона Н4 образуют тетрамер и связываются со 140 парами оснований ДНК, формируя основную сердцевину нуклеосомы. На втором этапе в эту структуру включаются по две молекулы гистонов Н2А и Н2В, чем и завершается образование нуклеосомы [42, 64, 258, 372]. При изучении сборки новореплицированного хроматина Drosophila показано, что гистоны Н3 и Н4 соединяются с ДНК в течение или вскоре после ее синтеза, гистоны Н2А и Н2В — на 2-10 мин позже, а гистон Н1 — через 10–20 мин, и в результате образуется зрелый хроматин [375]. По-видимому, во взаимодействие с ДНК вовлечены COOH-концы четырех гистонов, так как удаление ЫН2-концевых участков цепей гистонов не влияет на структуру нуклеосомы [371]. Гистоны Н2А и Н2В образуют димеры, взаимодействуя своими центральными неполярными областями, так что NH₂- и COOH-концы остаются свободными. Гистоны Н3 и Н4 образуют димеры путем образования связей между их центральными неполярными областями и COOH-концами, так что основные NH₂-концевые области нуклеосомных гистонов доступны для взаимодействия с кислотными группами ДНК [72]. Роль NH₂-концевых областей четырех гистонов пока не установлена, хотя известно, что они связываются с ДНК. Мирзабеков и др. [252] путем ковалентных сшивок гистонов с 5′-концевыми фрагментами ДНК показали, что каждый гистон связан с 10 парами оснований ДНК. Сборка нуклеосом, по-видимому, контролируется НГБ. Так, очищенный препарат этих белков, выделенный из яиц Xenopus laevis, в бесклеточной системе в присутствии гистонов и очищенной ДНК катализирует образование нуклеосом [217].

Таким образом, основная структура хроматина представляет собой цепь линейно расположенных нуклеосом диаметром 10 нм, которую называют нуклеосомной фибриллой. Это низший уровень организации хроматина. Структуру более высокого порядка образуют нуклеосомы, свернутые в спираль, которая имеет диаметр 20–30 нм и шаг 10 им. Свертывание нуклеосом в спираль, по-видимому, обеспечивается богатым лизином гистоном Н1, который, как было показано, соединяется с линкерной ДНК между соседними нуклеосомами. Этот вывод следует из того, что после расщепления мононуклеосом стафилококковой нуклеазой размер ДНК уменьшается с 200 до 140 пар оснований, причем одновременно освобождается 35-парный фрагмент ДНК, связанный с гистоном Н1 [20]. Когда гистон Н1 добавляли к хроматину, который был его лишен, увеличение сродства к нему наблюдалось только до стадии образования октануклеосомы, но не далее [301]. Связывание с гистоном Н1 не только стабилизирует ДНК в линкерной области, но вызывает также ее дальнейшую конденсацию и свертывание [75]. Более высокий порядок структуры хроматина (по сравнению с цепочкой бусин) представляет собой спираль из частиц октануклеосом, образование которой обеспечивается гистоном Н1 или гистоном Н5 (в случае эритроцитов, содержащих ядра). Это согласуется с результатами, согласно которым полинуклеосомы, содержащие около шести нуклеосом, являются, по-видимому, основными матрично активными единицами хроматина, связывающимися с эндогенной РНК-полимеразой [344]. Олигонуклеосомы служат лучшими матрицами для транскрипции, чем мононуклеосомы, и на них синтезируются более длинные транскрипты [318].

Нуклеосома — динамическая единица как в структурном, так и в функциональном отношении. Как сказано выше, она состоит из двух половин, что может быть определено путем специфического связывания восьми молекул гистонов с ДНК. То, что нуклеосомы в транскрипционно активном состоянии подвержены конформационным изменениям, становится очевидным при изучении их чувствительности к ДНКазе I. Этот фермент преимущественно воздействует на те последовательности ДНК, которые активно транскрибируются. Он удаляет ДНК, кодирующую глобин, из ядер эритроцитов цыпленка, но не действует на ядра клеток мозга или фибробластов [125, 282, 367]. На ДНК яичного альбумина эритроцитов и фибробластов, в которой этот ген не транскрибируется, фермент также не действует. Стафилококковая нуклеаза, которая, как известно, расщепляет ДНК в межнуклеосомной области, не расщепляет ДНК глобина из эритроцитов цыпленка. Если мономерные нуклеосомы, полученные из этих клеток действием стафилококковой ДНКазы, обработать затем ДНКазой I, то преимущественно удаляются гены глобина. Показано [125], что ген яичного альбумина предпочтительно расщепляется ДНКазой в клетках яйцевода курицы и не расщепляется в других клетках, в которых он не транскрибируется. В клетках хомяка, трансформированных аденовирусом, последовательности ДНК аденовируса, которые легко расщепляются ДНКазой I, представляют собой участки, с которых транскрибируется мРНК. Другие вирусные последовательности резистентны к этой нуклеазе [119]. Из приведенных наблюдений следует, что во время транскрипции происходят конформационные изменения в хроматине, так что ДНК становится более чувствительной к ДНКазе I, но ее чувствительность к стафилококковой нуклеазе остается прежней. Полученные результаты подтверждаются данными электронной микроскопии [313]. Показано, что в процессе развития ооцитов трех видов Xenopus транскрипционно активный ядрышковый хроматин выглядит гладким, нуклеосомы в нем присутствуют в небольшом количестве или вообще отсутствуют. Неактивный хроматин имеет вид бусин. Пониженная транскрипционная активность хроматина коррелирует с появлением бусин в его структуре, тогда как транскрипционно активный хроматин содержит больше мононуклеосом, чем транскрипционно неактивный, что и означает увеличение той области хроматина, которая активна при транскрипции [223]. Электронно-микроскопическое изучение активно транскрибируемых рибосомных генов Physarum polycephalum показывает, что ДНК в транскрибируемом участке имеет вытянутую конформацию [179]. Таким образом, структура хроматина и, в особенности, нуклеосом подвержена конформационным изменениям в процессе транскрипции, а возможно, и репликации. Не исключено, что это вызвано связыванием с НГБ. Для ковалентной модификации гистонов различных типов, па-пример фосфорилирования, ацетилирования, метилирования и ADPрибозилирования, необходимы эффекторы.

Негистоновые хромосомные белки

Белки, связанные с ДНК эукариотов и отличающиеся от гистонов, называют негистоновыми хромосомными белками (НГБ). Они были открыты в 1946 г. Мирским и Поллистером [251]. От ДНК их отделяют с помощью смеси 2 М NaCl и 5 М мочевины. К ним относятся белки, ответственные за экспрессию и репрессию генов хроматина, а также за метаболизм и модификации хромосомных белков [112]. Они имеют изоэлектрические точки от 3,7 до 9,0. Эти белки весьма неоднородны по размеру — их молекулярная масса может составлять от ~8000 до нескольких сотен тысяч. Период полужизни НГБ сильно варьирует, но в целом он много короче, чем у гистонов. Как и гистоны, они синтезируются в цитоплазме и затем переходят в ядра, где образуют комплексы с ДНК [366]. Если ввести НГБ в цитоплазму, они быстро проникают в ядра [378]. Клетки с более высокой метаболической активностью содержат большее количество НГБ, и этим последние отличаются от гистонов, содержание которых одинаково в клетках всех типов. НГБ присутствуют в хроматине всех тканей, но структура их в разных тканях различна как в количественном, так и в качественном отношении, т. е. эти белки ткане- и видоспецифичны. С помощью методов с высоким разрешением показано, что в каждой ткани имеются сотни типов НГБ. В глиальных клетках с помощью изоэлектрофокусирования и микродиск-электрофореза было обнаружено почти 1500 НГБ [211]. По всей вероятности, некоторые из них представляют собой модифицированные НГБ, причем они синтезируются в течение всего клеточного цикла, тогда как гистоны синтезируются только в S-фазе.

После обработки хроматина тимуса теленка 0,3 М NaCl НГБ по подвижности в геле делятся на две группы: высокоподвижная группа (HMG, от англ. high mobility group) с мол. массой менее 30000 и малоподвижная группа с мол. массой более 30000 [176–178]. К HMG-белкам относятся четыре белка с большим зарядом: HMG₁ HMG₂, HMG₁₄ и HMG₁₇. Они включают 25 % основных и 30 % кислотных остатков и составляют только 3 % веса ДНК; они присутствуют во всех тканях и не являются тканеспецифичными [297]. Белки HMG ассоциированы с нуклеосомой [134]. Белки HMG₁ и HMG₂ имеют мол. массу около 26000. Они взаимодействуют с ДНК своими основными остатками [382, 383]. Около 50 % остатков HMG₁ заряжены. Необычным является то, что его COOH-концевая область содержит последовательность из 41 чередующихся остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот. Каждое ядро из тимуса теленка содержит ~106 молекул белков HMG₁ [59, 361]. По-видимому, белки HMG играют в хроматине структурную, а не регуляторную роль. Белок HMG₁ в отличие от трех остальных не содержит ароматических аминокислот. Он включает последовательность из 89 остатков и имеет мол. массу 9247. Его карбоксильный конец представляет собой цепь кислотных остатков, а NH₂-конец — цепь основных остатков; центральная область богата остатками лизина. HMG₁₇ не имеет вторичной и третичной структуры, а по последовательности входящих в него аминокислотных остатков он гомологичен гистонам Н1 и Н5. Его уникальная первичная структура с цепями кислотных и основных остатков указывает на то, что он может быть структурным белком. Показано, что белок HMG₁₇ связывается приблизительно с 57 нуклеотидами ДНК из тимуса теленка и вызывает конформационные изменения в ДНК, сходные с теми, которые производит гистон Н1 [174], причем с ДНК связываются остатки с 15 по 40 [1].

Поскольку белки HMG имеют кислотные и основные остатки, образующие кластеры, они могут связываться с гистонами. своими кислотными группами, а с ДНК — основными остатками. Белки HMG₁ и HMG₂ ассоциированы с нуклеосомой [29]. Они стабилизируют двойную спираль ДНК, поскольку при ассоциации с ними ее Т_m увеличивается на 20 °C [382, 383]. Таким образом, имеются достаточные основания полагать, что белки HMG играют в хроматине структурную роль. При воздействии ДНКазы I на активную часть хроматина белки HMG удаляются. По-видимому, эти белки связаны с нуклеосомами [326]. Дефер и др. [98] также сообщают, что НГБ связаны с нуклеосомами. Существуют экспериментальные доказательства структурной роли некоторых НГБ [7, 8]. Метафазные хромосомы клеток HeLa сохраняют свою морфологию даже после того, как удалены все гистоны и большинство НГБ. Структура поддерживается лишь с помощью ~30 % НГБ, причем в их число входит около 30 типов НГБ с мол. массой ~75000. Каждая хроматида находится в спаренном состоянии, как в метафазе, и остается стабильной даже в 2 М NaCl. Установлено также, что после удаления гистонов из метафазных хромосом их общий размер уменьшается на 50 %, и это не приводит к заметным нарушениям в их морфологии [175]. Отсюда следует, что НГБ ответственны за поддержание метафазной структуры хромосом, а, возможно, также и структур других фаз клеточного цикла. Есть сообщения [44, 265], что НГБ участвуют в процессе закручивания ДНК в сверхспираль и в образовании структуры хроматина высшего порядка. В связи с этим было высказано предположение, что НГБ образуют "строительные леса", или каркас, определяя таким образом основную форму метафазной хромосомы, и в соответствии с этим каркасом ДНК сворачивается в петли.

НГБ очень неоднородны, число их велико, и некоторые из них ткане- и видоспецифичны. Общее содержание НГБ в разных тканях соответствует следующему ряду: мозг>печень>>почки>>селезенка>тимус [255]. Некоторые НГБ специфичны для каждой ткани, а относительные количества индивидуальных НГБ варьируют от ткани к ткани. Они претерпевают количественные и качественные изменения при различных физиологических условиях, а также в процессе эмбриогенеза, дифференцировки клеток и клеточного цикла. Некоторые НГБ слабо связаны с ДНК и легко экстрагируются, другие связаны сильнее. Благодаря своим свойствам они участвуют в регуляции экспрессии генов в целом [202, 285, 325, 332, 347] и в контроле транскрипции в частности [27, 186, 193]. Показано [347], что фракция НГБ из печени крысы стимулирует транскрипцию in vitro. Когда НГБ добавляют к хроматину эмбриона морского ежа, увеличивается число участков инициации синтеза РНК [245]. Аналогичные наблюдения сделаны на клетках асцитного рака Эрлиха: фракция слабо связанных НГБ избирательно ассоциирует с гомологичной ДНК и стимулирует транскрипцию специфических структурных генов в присутствии РНК-полимеразы эукариот [202, 203]. Удалось идентифицировать [203] фосфорилированный НГБ с мол. массой 11000, который ингибирует инициацию транскрипции и играет регуляторную роль в экспрессии генов. Сообщалось также об участии в регуляции специфической активности генов сильно связанных НГБ [40, 82]. Катино и др. [73] изолировали НГБ с мол. массой 31000, который в большом количестве содержится в неделящихся клетках, но в малом количестве — в делящихся, как, например, в гепатоме Новикова. Когда НГБ выделяли из хроматина с помощью 5 М мочевины (М₀), смеси 5 М мочевины и 1 М NaCl (M₁) и смеси 5 М мочевины и 3 М NaCl (M₃) и изучали роль каждой полученной фракции в транскрипции комплекса ДНК — гистон из печени кролика, оказалось, что функции этих трех фракций различны [30]. Фракция М₀ стимулирует транскрипцию, связываясь с хроматином и изменяя общую конформацию комплекса ДНК — гистон. Фракция М₃ связывается более специфическим образом и раскрывает новые центры для связывания РНК-полимеразы. Фракция M₁ включает, по-видимому, структурные компоненты хроматина.

Метаболически более активные клетки содержат большее число НГБ. Обычно НГБ локализованы в тех областях хроматина, которые более активны в процессе синтеза РНК [90, 376]. НГБ способны прекращать репрессию матричной активности, вызываемую гистонами [110, 319]. Некоторые фосфорилированные НГБ специфически взаимодействуют с гистонами Н1 и Н2В и поэтому могут удалять их и открывать участки ДНК для транскрипции [247]. НГБ способны переводить неактивные покоящиеся клетки, находящиеся в фазе G₀, в активно растущие в стадии G₁. В процессе этого перехода происходит синтез специфических типов НГБ и одновременно увеличивается матричная активность [158, 222, 305]. Отсюда был сделан вывод, что эти белки участвуют в дерепрессии или в положительной регуляции экспрессии генов, особенно в контроле транскрипции в течение клеточного цикла.

При введении цыпленку эстрадиола или прогестерона синтез НГБ в яйцеводе стимулируется. НГБ в яйцеводе крыс, принимавших гормональные препараты, качественно отличны от белков контрольных животных [156]. Полагают, что в ядре акцептором для прогестерон-рецепторного комплекса является НГБ. Глюкокортикоид-рецепторный комплекс лучше связывается с хроматином печени, чем с хроматином тимуса, простаты и матки. Если из хроматина удалить гистоны, то в оставшемся хроматине связывание комплекса увеличивается вдвое. Если же удалить все хромосомные белки, то связывание рецепторного комплекса глюкокортикоида с ДНК уменьшается на 50 %. Отсюда следует, что НГБ ответственны за связывание рецепторного комплекса гормона с ДНК [151]. Синтез НГБ стимулируется кортизоном [14] и глюкагоном [113]. Стероидные гормоны, индуцирующие фосфорилирование НГБ в яйцеводе [88], а также кальцитонин и гормоны паращитовидной железы, которые оказывают противоположное действие на метаболизм кальция в костных клетках, стимулируют фосфорилирование различных НГБ [60].

Экдизон — стероидный гормон, ответственный за развитие насекомых — вызывает образование пуффов в хромосомах слюнных желез у личинок Sciara [133]. Возникновение пуффа указывает на то, что в данном участке происходит транскрипция. В месте пуффа, вызванного действием экдизона, не наблюдается увеличения содержания гистонов или ДНК, в то время как содержание НГБ почти удваивается. Пуффы образуются лишь после окончания определенной стадии развития, когда клетки становятся компетентными (17-дневные личинки); они не появляются у 4-дневных личинок. Это свидетельствует о том, что для действия экдизона необходим какой-то цитоплазматический фактор, вероятно белок. Следовательно, прежде чем экдизон сможет оказать воздействие на специфические гены, должен быть активирован определенный ген, ответственный за синтез этого белка. При возникновении пуффов в политенных хромосомах Drosophila отношение белков к ДНК увеличивается с 6 до 16, количество РНК увеличивается вдвое, а Т_m данного участка понижается на 10 °C [281]. Кроме того, около пуффов накапливаются НГБ. В содержании ДНК и гистонов, связан дается никаких изменений, а большая часть гистонов, связанных с ДНК, оказывается дестабилизированной. Эти наблюдения подтверждаются результатами, полученными с помощью иммунофлуоресценции, согласно которым пуффы, индуцированные в политенных хромосомах Drosophila тепловым ударом, содержат новые НГБ. Очевидно, НГБ ответственны за активацию генов.

Воздействие НГБ на экспрессию специфических генов изучалось рядом исследователей [173, 284, 351]. Когда НГБ клеток HeLa добавляли к хроматину этих клеток в фазе G₁, начиналась транскрипция генов гистонов, хотя обычно в этой фазе их экспрессии нет. При воссоединении хроматина в S-фазе клеток W1-38 с S-фазными НГБ наблюдается 500-кратная стимуляция транскрипции генов гистонов, в то же время при воссоединении хроматина печени мыши с S-фазными НГБ клеток HeLa транскрипции генов глобина не происходит. Эксперименты по реконструкции с использованием хроматина эритроцитов цыпленка показали: для того чтобы вызвать транскрипцию генов глобина, определенная фракция НГБ должна связываться с ДНК раньше, чем с гистоном [124]. После того как удалось разделить хроматин клеток тимуса теленка и костного мозга на ДНК, гистоны и НГБ, полученные компоненты были использованы в опытах по реконструкции [131]. Оказалось, что в случае клеток тимуса синтезированные РНК похожи на РНК тимуса, а мРНК глобина не синтезируются. Когда же был реконструирован и использован для транскрипции хроматин костного мозга, мРНК глобина синтезировались. Вместе с тем если в реконструкции участвовали ДНК и гистон тимуса и НГБ костного мозга, то также происходил синтез мРНК глобина. Отсюда следует, что НГБ, вероятно, участвуют в регуляции специфических генов. В культуре клеток мышц НГБ активно фосфорилируются главным образом во время дифференцировки [221]. Установлено также, что НГБ принимают участие в положительном контроле экспрессии генов. Однако для того, чтобы идентифицировать специфические компоненты НГБ, участвующих в контроле, и установить точный механизм контроля, необходимы дальнейшие исследования.

Модификации хромосомных белков

Посттрансляционная ковалентная модификация происходит в боковых группах аминокислотных остатков нескольких белков [357]. Хромосомные белки — как гистоны, так и НГБ — синтезируются в цитоплазме и затем переходят в ядро, где они связываются с ДНК. Эти белки, особенно гистоны, подвергаются разнообразным посттрансляционным ковалентным модификациям: фосфорилированию, ацетилированию, метилированию и ADPрибозилированию. Ацетилирование NH₂-концевого серинового остатка гистонов Н1, H2A и Н4 происходит во время трансляции и представляет собой стабильную модификацию [229]. Ацетилирование внутренних лизиновых остатков гистонов Н3 и Н4 и фосфорилирование внутренних сериновых остатков происходит в цитоплазме. Затем эти гистоны переходят в ядра и связываются с ДНК [308]. Ацетилирование внутренних лизинов обратимо. Кроме того, обратимая модификация лизиновых остатков происходит уже после связывания гистонов с ДНК. Путем ковалентных модификаций четырех типов изменяются ионный состав гистонов и их стерические свойства, а следовательно, и взаимодействие с ДНК (рис. 2.4).

Рис. 2.4. Структура хроматина с указанием центров связывания гистонов и НГБ с ДНК. Представлены ковалентные модификации гистонов, в результате которых изменяется их связывание с ДНК

При таких модификациях, как фосфорилирование и ADPрибозилирование, число отрицательных зарядов на гистонах увеличивается, и это может привести к их отделению от ДНК, в результате чего становится возможной ее транскрипция или репликация. При ацетилировании общий положительный заряд на гистонах уменьшается. Это также может приводить к их отделению от ДНК. Вместе с тем при метилировании положительный заряд на молекулах гистонов может увеличиваться, что приводит к более сильному связыванию их с ДНК и, как следствие, к подавлению активности генов. Специфические аминокислоты подвержены специфическим модификациям. Определенные модификации преимущественно происходят в определенных гистонах и к тому же на специфических фазах клеточного цикла и роста клетки. Таким образом, не исключено, что модификации боковых групп хромосомных белков являются механизмом тонкой регуляции экспрессии генов. В табл. 2.3 приведены некоторые характеристики этих модификаций.

Таблица 2.3. Параметры ковалентных модификаций цепей гистонов

Фосфорилирование

Фосфорилирование хромосомных белков представляет собой энергозависимую постсинтетическую модификацию. Оно происходит как в цитоплазме, так и в ядре [273, 276, 308]. Орд и Стокен [275] продемонстрировали включение в гистоны 32P in vivo. Позднее было показано, что гистон Н1 фосфорилируется в большей степени, чем другие гистоны [23]. Главными центрами фосфорилирования с помощью специфических с АМР-зависимых протеинкиназ являются боковые группы сериновых и треониновых остатков гистонов и НГБ. Лизиновые, гистидиновые и аргининовые остатки фосфорилируются в малой степени. Киназы присутствуют во фракции НГБ хроматина. В фосфорилировании специфических центров, по-видимому, участвуют специфические гистоновые киназы. Из хроматина тимуса быка удалось выделить АМР-зависимую киназу, которая фосфорилирует единственный центр в гистоне Н3 [321]. Дефосфорилирование этих остатков производится фосфатазами, которые также присутствуют во фракции НГБ. Надежно установлено, что фосфорилирование и дефосфорилирование ферментов являются одним из основных механизмов регулирования их активности, поскольку эти модификации, вызывая конформационные изменения, переводят ферменты из активного состояния в неактивное, и наоборот [137]. При подобных модификациях в молекулах хромосомных белков происходят структурные изменения, которые могут приводить к функциональным изменениям хроматина. Реакция фосфорилирования — дефосфорилирования гистона показана ниже:

В молекулах хромосомных белков обнаружены два типа присоединения фосфатных групп [79]. Один из них, включающий связь Р-О, характерен для сериновых и треониновых остатков, причем эта связь устойчива по отношению к кислоте. Второй тип включает связь P-N, которая образуется в лизиновых, гистидиновых и аргининовых остатках. Эта связь неустойчива в кислых средах.

Фосфорилирование гистонов

Процесс фосфорилирования — дефосфорилирования внутренних остатков хромосомных белков совершается с большой скоростью. Быстрое фосфорилирование наблюдается не только в делящихся, но и в неделящихся клетках после их стимуляции различными эффекторами. В основном фосфорилированию подвержен гистон Н1, т. е. фосфорилирование гистонов, по-видимому, не влияет на транскрипционную активность хроматина.

Центры фосфорилирования гистона Н1 различны на разных стадиях клеточного цикла. Ser-37 фосфорилируется в фазе G₁, Ser-114 в фазах S и G₂, Ser-180 — в фазе М [206]. По-видимому, это объясняется множественностью Н1-киназ, каждая из которых специфична. Было показано, что быстрорастущие клетки содержат специфичную гистон-киназу, которая катализирует фосфорилирование треониновых остатков, но не Ser-37 и Ser-105 [216]. При фосфорилировании одного из остатков Ser-37 и Ser-105 или обоих степень связывания гистона Н1 с ДНК значительно уменьшается [299]. Такие различия в свойствах разных центров фосфорилирования могут объяснять функциональную роль гистона Н1 в конденсации хроматина. При фосфорилировании различных центров хроматин деконденсируется различным образом, благодаря чему открываются разные участки ДНК.

Показано, что фосфорилирование гистонов связано с изменениями в структуре хроматина особенно во время митоза [140, 143, 144]. Высокая скорость фосфорилирования наблюдается во время митоза клеток яичника китайского хомячка. Такие же модификации наблюдаются в клетках HeLa [209, 210]. Центры фосфорилирования гистона Н1 при митозе (Him) отличаются от центров во время интерфазы (НИ) [25, 162., 209]. Было выдвинуто предположение, что фосфорилирование гистона Н1 необходимо для конденсации интерфазного хроматина в хромосомы. Это совпадает с данными, согласно которым трижды фосфорилированный гистон Н1 связывается с ДНК сильнее, чем дефосфорилированный [196]. У слизистого гриба Prysarum polycephalum фосфорилирование гистона Н1 увеличивается в середине фазы G₂ и резко нарастает вплоть до профазы [253]. Дефосфорилирование происходит в последней стадии митоза.

Фосфорилирование различных центров наблюдается также у гистона Н3, но оно не обнаружено у гистонов Н2А, Н2В и Н4. В детальных исследованиях фосфорилирования гистонов Н1 и Н3 из яичника китайского хомячка в процессе митоза было показано, что у большинства клеток эукариот 2–4 центра в гистоне Н1 фосфорилируются в фазе S и дополнительные центры во время митоза (М) [25]. Центры фосфорилирования в фазах S и М, по-видимому, независимы. Более того, эти центры отличаются от тех, которые участвуют в ответе на действие гормона [216]. На ранних стадиях препрофазы, когда начинается агрегация хроматина, гистон Н1 имеет 1–3 фосфатные группы на молекулу, а гистон Н3 не фосфорилируется [95, 140]. Во время промета- и анафазы, когда хроматин агрегирует, все молекулы гистона Н1, а также Н3 суперфосфорилируются и имеют 3–6 фосфатных групп на молекулу. Это может быть обусловлено 6-10-кратным увеличением в митотических клетках содержания специфической АТР-гистон-фосфотрансферазы [209, 210]. Благодаря суперфосфорилированию фибриллы хроматина способны скручиваться в сверхспирали. В телофазе, когда хроматин дезагрегирует, оба гистона, Н1 и Н3, дефосфорилируются. Когда клетки вступают в фазу G₁, гистон Н1 полностью дефосфорилируется. Таким образом, суперфосфорилирование гистона Н1m и фосфорилирование гистона Н3 являются митотическими событиями, которые происходят только тогда, когда хромосомы полностью конденсированы. Следовательно, для конденсации хроматина во время митоза необходима высокая степень фосфорилирования гистонов Н1 и Н3, тогда как дефосфорилирование ограничивает этот процесс в интерфазе. Удивляет, однако, тот факт, что при высокой степени фосфорилирования, когда, казалось бы, должна была происходить диссоциация комплекса гистонов Н1 и Н3 с ДНК из-за увеличения отрицательных зарядов на них, наблюдается увеличение конденсации. Для того чтобы выяснить фундаментальный механизм, с помощью которого происходят конденсация и деконденсация хромосом, необходимы дальнейшие исследования. В печени крысы в период развития фосфорилирование гистона Н1 значительно, но оно пренебрежимо мало в печени взрослых животных [22]. Однако фосфорилирование усиливается, когда клетки печени делятся после частичной гепатэктомии [24]. Показано, что в этих условиях отношение числа связей P-O к P-N в печени меняется [79]. P-N-связи обнаруживаются главным образом в гистонах Н1 и Н4. Содержание Hl-киназы на протяжении клеточного цикла не меняется, но количество Н4-киназы увеличивается во время синтеза ДНК. Гистон Н4 также максимально фосфорилируется в фазе S, примем центрами атаки являются гистидиновые остатки. Таким образом, в результате фосфорилирования гистон Н4 может отделяться от ДНК, что способствует ее репликации. Отсюда можно, по-видимому, заключить, что фосфорилирование гистонов необходимо для репликации ДНК, за которой следует деление клетки [26, 161]. Показано, что транскрипция изолированных нуклеосом печени крысы после фосфорилирования усиливается [278]. Фосфорилированный и нефосфорилированный гистоны Н1 отличаются друг от друга по способности подавлять матричную активность хроматина [365]. С помощью метода кругового дихроизма было обнаружено, что фосфорилированные гистоны обладают измененной конформацией [6]. Этим может объясняться тот факт, что модифицированные гистоны вызывают дерепрессию хроматина.

Гистон Н5 также подвержен фосфорилированию. В эритроцитах птиц гистон Н5 фосфорилируется вскоре после его синтеза и затем дефосфорилируется по мере созревания клетки [335]. В отличие от других гистонов гистон Н5 дефосфорилируется в период инактивации генома и конденсации хромосом. Фосфорилированный гистон Н5 не так эффективно вызывает изменение конформации ДНК, как его дефосфорилированная форма. Фосфорилированные остатки (серии) обнаруживаются в областях гистона Н5, имеющих сильноосновный характер и связанных с ДНК. 50 % фосфатов находится в области 1-28, а остальные — на участке 100–200. В процессе сперматогенеза у некоторых видов млекопитающих протамины претерпевают фосфорилирование — дефосфорилирование, что, по-видимому, необходимо для упаковки ДНК [242].

Фосфорилирование НГБ

НГБ фосфорилированы в высокой степени и содержат как P-O-, так и P-N-связи. Полагают, что их фофорилирование катализируют киназы, отличные от тех, которые катализируют фосфорилирование гистонов. Существенным для фосфорилирования является содержание протеинкиназ и сАМР [180]. Кальцитонин стимулирует фосфорилирование НГБ костных клеток в культуре, особенно белков с малой молекулярной массой (10000-45000), но подавляет фосфорилирование НГБ с большой молекулярной массой. Вместе с тем гормон паращитовидной железы стимулирует фосфорилирование НГБ с большой молекулярной массой. Таким образом, два пептидных гормона, противоположным образом влияющие на метаболизм кальция, могут реализовать свое действие с помощью фосфорилированных НГБ. Стероидные гормоны также индуцируют фосфорилирование НГБ [88, 183].

Фосфорилирование НГБ зависит от типа клеток и их физиологического состояния [191]. Скорость этого процесса в синхронизированных клетках HeLa in vitro меняется, причем самая большая скорость наблюдается в фазах G₁ и S. Когда покоящиеся клетки LC начинают быстро размножаться, одним из самых ранних событий является фосфорилирование НГБ. При добавлении к ядрам клеток печени крыс полиаминов, спермина и спермидина активность протеинкиназы ядер повышается в 2–3 раза, а скорость фосфорилирования НГБ — во много раз [115]. У Physarlum полиамины стимулируют фосфорилирование нескольких уникальных НГБ [19].

В отличие от фосфорилированных гистонов, которые влияют на структуру хроматина, фосфорилированные НГБ участвуют в экспрессии генов [284, 306, 332, 351]. Фосфорилированные НГБ клеток HeLa в фазе G₁ стимулируют транскрипцию генов гистона в фазе G₁, хотя в данной фазе эти гены не активны. Фосфорилированные НГБ усиливают транскрипцию, а дефосфорилированные уменьшают ее [85, 270]. Механизм этого воздействия, вероятно, заключается в непосредственном взаимодействии белков с ДНК. Такой вывод вытекает из следующих наблюдений: НГБ обладают различной способностью к фосфорилированию, способ их фосфорилирования зависит от типа ткани; при изменениях в их фосфорилировании изменяются структура хроматина и активность генов, а фосфорилированные НГБ специфически связываются с ДНК. НГБ клеток карциномы молочной железы в стадии зависимого от гормона роста и во время регрессии фосфорилируются по-разному [83]. Когда хроматин фибробластов W1-38 человека реконструируют из ДНК и нефосфорилированных или фосфорилированных НГБ, в последнем случае степень транскрипции много больше [295].

Ацетилирование

Есть сообщение о наличии у гистонов ацетильных групп [288]. Ацетилирование гистонов в изолированных ядрах впервые было описано Олфри с сотрудниками [13]. В гистонах обнаружены ацетилированные аминокислотные остатки двух типов: а) NH2-концевой серии гистонов Н1, Н2А и Н4 ацетилируется в N-ацетилсерин; это необратимая постсинтетическая модификация, катализируемая ферментом, содержащимся в цитозоле; б) ацетилированные внутренние лизиновые остатки образуются в результате постсинтетической реакции, протекающей в цитозоле [308] и в ядре после того, как гистоны переходят из цитозоля в ядро и связываются с ДНК [65]. Ацетилирование внутренних остатков в гистоне Н1 либо незначительно, либо вообще отсутствует. Ацетилируется один центр в гистоне Н2А и по четыре центра в каждом из гистонов Н2В, Н3 и Н4. Ацетилирование лизиновых остатков катализируется ацетилтрансферазой, являющейся компонентом НГБ. ε-NH₂-группы внутренних лизиновых остатков, расположенных на NH₂-концах половины гистонов, ацетилируются с образованием ε-N-ацетиллизина [11, 101, 130], причем в одной молекуле может содержаться до четырех ацетильных групп. Это энергозависимая реакция, в которой источником ацетильной группы является ацетил-CoA. Деацетилирование катализируется деацетилазой, которая также присутствует в хроматине. Схема реакции приведена ниже:

Ацетилируются внутренние лизиновые остатки 9, 14, 18 и 23 гистона Н3 и 5, 8, 12 и 16 гистона Н4 [67, 99]. Эти остатки расположены в NH₂-концевой области полипептидной цепи, которая является сильно основной и взаимодействует с кислотными группами ДНК. Ацетилированные гистоны связываются с ДНК менее эффективно, чем деацетилированные [6]. Ацетилирование внутренних лизиновых остатков — процесс обратимый и происходит весьма быстро при самых разных условиях. Период полупревращения реакции ацетилирования очень мал и составляет всего около 3 мин [172, 267]. Были изолированы две гистон-ацетилтрансферазы, имеющие различные оптимумы рН. Ацетилирование ингибируется ионами Mn2+. Этот факт представляется важным, поскольку двухвалентные катионы необходимы для функционирования ДНК-зависимой РНК-полимеразы. сАМР, влияющая на фосфорилирование, не действует на ацетилирование [33]. Максимальная скорость ацетилирования достигается в интерфазе, по мере вхождения клеток в митоз она уменьшается. Минимальная скорость реакции наблюдается в профазе и метафазе, когда хромосомы в наибольшей степени конденсированы [95]. По мере того как клетки входят в телофазу и хромосомы увеличиваются в размере, скорость ацетилирования гистона Н4 увеличивается. Минимальный синтез РНК наблюдается в профазе и метафазе, когда хромосомы сильно конденсированы. Важно, что ацетилирование гистона Н4 также минимально именно в этих двух фазах клеточного цикла [33]. Ацетилирование гистонов Н3 и Н4 в эритробластах птиц уменьшается по мере их превращения в зрелые эритроциты, в которых хроматин сильно конденсирован и неактивен ни в транскрипции, ни в репликации [309]. Таким образом, деацетилирование гистонов коррелирует с ингибированием транскрипции, и наоборот, ацетилирование стимулирует транскрипцию. Так как при ацетилировании нуклеосомных гистонов уменьшается их положительный заряд, они могут отделяться от ДНК, благодаря чему ДНК делается доступной для транскрипции.

Если хроматин депротеинизируется, то его транскрипция усиливается [167]. Показано, что при стимуляции синтеза РНК в лимфоцитах митогенами [289], в тканях-мишенях — гормонами [228] и в печени — после частичной гепатэктомии [290] сначала происходит ацетилирование гистонов. В результате ацетилирования нуклеосомных гистонов усиливается транскрипция хроматина тимуса теленка [241]. Если гистоны Н2А и Н2В добавить к ДНК, лишенной хроматина, то транскрипция подавляется. Однако если эти два гистона затем ацетилируются, то репрессия прекращается. При ацетилировании гистонов Н3 и Н4 также наблюдается стимуляция транскрипции. Показано, что ацетилирование предшествует увеличению синтеза РНК [308]. Ацетилирование гистонов происходит не только в делящихся, но и в неделящихся клетках, в которых значительная часть хроматина неактивна в отношении транскрипции [66]. Ацетилирование гистонов стимулирует удлинение цепей при транскрипции [241]. Возможно, что транскрипция генов, которые специфически "включаются" эффекторами, контролируется степенью ацетилирования гистонов и (или) НГБ.

Приведенные выше заключения подтверждаются следующими фактами. Транскрипционно неактивный гетерохроматин инфузорий имеет низкую степень ацетилирования, тогда как эухроматин транскрипционно активен и сильно ацетилирован [232]. Транскрипционно активные макроядра Tetrahymena pyriformis содержат ацетилированные гистоны, тогда как в репрессированных микроядрах их нет [136]. Активные материнские хромосомы червеца содержат значительно больше ацетильных групп, чем неактивные отцовские хромосомы [34]. В исследованиях, выполненных на клетках Drosophila в культуре [227], показано, что 14С-ацетат включается главным образом в гистоны Н3, Н4 и Н2В, а 32Р-фосфат — в гистоны Н1, Н3 и Н4. Самое высокое содержание как 14С-ацетата, так и 32Р наблюдается в гистоне Н3. Когда матрично активные и матрично неактивные области хроматина разделяли после его переваривания ДНКазой II, было обнаружено, что первые содержат большее количество обеих меток (14С и 32Р). Эти данные подтверждают предположение, что различия между транскрибируемыми и нетранскрибируемыми областями хроматина отчасти объясняются специфическими модификациями гистонов в определенных локусах.

Степень ацетилирования гистонов из клеток семенника форели изучали путем инкубирования их с 14С-ацетатом [96]. Гистоны Н2А, Н2В и Н3 ацетилируются в одном положении, в то время как гистон Н4 — в одном, двух, трех и четырех положениях. Когда нуклеосомы, полученные после ацетилирования, обрабатывали трипсином, при этом удаляли NH₂-концевые области четырех гистонов, содержащие лизиновые остатки и связанные с ДНК. Эти лизиновые остатки как раз и были ацетилированы. Если нуклеосомы затем расщепляли нуклеазой, то освобождались фрагменты ДНК, обычно при наличии NH₂-концевых областей устойчивые к нуклеазе [368]. Ацетилирование приводит к увеличению скорости расщепления хроматина ДНКазой I [268, 362]. Хроматин, содержащий высокоацетилированные гистоны, легче расщепляется ДНКазой I, но не микрококковой нуклеазой [244]. Когда хроматин из семенника форели гидролизовали ДНКазой II, получали транскрипционно активную фракцию, содержащую высокоацетилированный гистон Н4 [97]. Гистоны Н3 и Н4 клеток HeLa сильно ацетилируются при выращивании в бутирате. Нуклеосомная ДНК таких клеток гидролизуется ДНКазой I в 5-10 раз быстрее. При этом ДНК специфически расщепляется в сайте, где в нормальных условиях разрыва не происходит [324]. Показано также [268, 315, 316], что ДНКаза I предпочтительно расщепляет ДНК в тех областях хроматина, которые сильно ацетилированы. По-видимому, нуклеосомы в этих областях после ацетилирования подвергаются конформационным изменениям. Поскольку такие изменения необходимы для того, чтобы РНК- и ДНК-полимеразы могли использовать ДНК в качестве матрицы, не исключено, что ацетилирование представляет собой один из. способов, с помощью которого гистоны частично отделяются от ДНК, благодаря чему последняя становится доступной для ферментов. Таким образом, ацетилирование важно как для функционирования хроматина, так и для его структуры и конформации. Высказано предположение, что гистон Н4 связывается с ДНК по механизму, на первых стадиях которого происходит ацетилирование [236]. Затем может произойти деацетилирование, приводящее к электростатическим взаимодействиям, в результате которых закрепляется конформация. В сперматиде морского ежа, не синтезирующей РНК, гистон Н4 полностью деацетилирован, тогда как в эмбрионе, где наблюдается высокая активность генов, он ацетилирован [53]. Таким образом, между ацетилированием гистона Н4 и активностью хроматина наблюдается прямая корреляция.

Изучению роли ацетилирования гистонов в функционировании хроматина способствовало обнаружение того факта, что в присутствии бутирата эта модификация усиливается и гистоны Н3 и Н4 специфически гиперацетилируются [68, 302, 315], так как бутират ингибирует гистон-деацетилазу. Бутират ингибирует предпочтительно эндогенную деацетилазу гистонов Н3 и Н4 [287], и при этом он не влияет на скорость ацетилирования [41, 68, 300]. По-видимому, гистон-деацетилаза может играть важную роль в метаболическом контроле ацетилирования. При гиперацетилировании гистонов связанная с ними ДНК в клетках HeLa становится более доступной для ДНКазы I, но не для стафилококковой нуклеазы. ДНКаза I способствует также удалению из комплекса гистонов Н3 и Н4 [359]. Одновременно подавляется синтез ДНК [146]. Можно предположить, что ацетилирование гистонов специфически необходимо для транскрипции и не нужно для репликации. В отличие от фосфорилирования, которое характерно для гистона Н1 и только делящихся клеток, ацеталирование протекает главным образом в гистонах Н3 и Н4 и в делящихся, а также неделящихся клетках, которые метаболически активны. Это подтверждает предположение, согласно которому ацетилирование нуклеосомных гистонов играет важную роль в транскрипции. Об ацетилировании НГБ известно очень мало; в одной из работ сообщается, что ацетилируются белки HMG из ядер тимуса теленка и эритроцитов утки [333].

Метилирование

Метилирование гистонов является постсинтетической необратимой модификацией, которая катализируется гистон-метилтрансферазой III, присутствующей во фракции НГБ хроматина. Эта модификация была впервые обнаружена Олфри и сотрудниками [13]. Гистон-метилтрансфераза III катализирует переход СН₃-группы из S-аденозилметионина в ε-NH₂-группу лизинового остатка, как показано ниже: