Мусорная ДНК. Путешествие в темную материю генома

Рис. 14.1. График показывает, что по мерю увеличения сложности организма доля мусорной ДНК в геноме нарастает быстрее и отчетливее, чем размер части, кодирующей белки.

Множественные параметры

ENCODE рассчитывал долю функционирующих участков в нашем геноме, объединив всевозможные данные. В число этих данных вошла и информация о молекулах РНК, которые удалось обнаружить участникам проекта. Среди этих РНК оказались представлены как кодирующие белки, так и не кодирующие их, то есть мусорные РНК. Все они имели самую разную длину — от молекул протяженностью в тысячи нуклеотидных оснований до молекул в сотню раз меньше. Кроме того, ENCODE считал геномные области имеющими функции, если такие зоны несли на себе определенные комбинации эпигенетических модификаций, обычно связываемые с функциональными областями. Другие подходы предполагали, в частности, анализ участков, которые образуют петли и благодаря этому сближаются. Еще одна методика подразумевала характеризацию генома по специфическим физическим свойствам, связываемым с той или иной функцией[43].

Свойства эти отличались у разных типов человеческих клеток, что подтвердило гипотезу, согласно которой клетки могут использовать одну и ту же геномную информацию весьма гибко. К примеру, изучение образования петель показало, что одна разновидность взаимодействий между различными участками генома наблюдается лишь у каждого третьего из исследованных типов клеток7. Это позволяет предположить, что сложная трехмерная укладка нашего генетического материала — явление комплексное и зависящее от типа клетки.

Изучая физические характеристики, обычно связываемые с регуляторными областями, ученые пришли к выводу, что регуляторные участки ДНК также активируются в зависимости от типа клетки — и что, в свою очередь, характер клетки (то, какой она станет) формируется под действием этой мусорной ДНК8. К этому выводу исследователи пришли после того, как выявили около 3 миллионов таких мест (сайтов) путем анализа клеток 125 различных типов. Это не означает, что у клеток каждого типа 3 миллиона сайтов. Это лишь означает, что, проанализировав все эти клеточные типы, ученые обнаружили 3 миллиона сайтов. Опять-таки, это наводит на мысль, что регуляторный потенциал генома может использоваться по-разному — в зависимости от нужд той или иной клетки. Распределение сайтов по клеточным типам упрощенно показано на рис. 14.2.

Рис. 14.2. Анализируя наборы данных проекта ENCODE, ученые выявили свыше трех миллионов сайтов с характеристиками регуляторных областей (исследуя множество клеточных линий человека). Площади кругов отражают распределение таких сайтов. Большинство их обнаруживали в клетках двух и более типов, хотя значительная их доля оказалась специфической для отдельных типов клеток. И лишь очень малую часть сайтов удалось найти в каждой из проанализированных клеточных линий.

Свыше 90% регуляторных участков, выявленных благодаря этому методу, находились более чем за 2500 пар нуклеотидных оснований от начала ближайшего гена. Иногда они располагались вдали от всех генов, а иногда — в мусорной области, входящей в состав гена, но все равно они размещались далеко от его начала.

Большинство промоторов генов ассоциированы более чем с одним таким участком, а каждый такой участок обычно ассоциирован более чем с одним промотором. Однако, опять-таки, наши клетки, судя по всему, контролируют генетическую экспрессию отнюдь не прямолинейно. Они используют сложные сети взаимодействующих узлов.

Среди наиболее поразительных данных — информация, позволяющая предположить, что более 75% нашего генома хоть когда-нибудь, хоть в каких-нибудь клетках копируется в РНК9. Любопытное предположение. Никто не мог ожидать, что три четверти мусорной ДНК наших клеток может реально использоваться для производства РНК. При сравнении информационных РНК, кодирующих белки, с длинными некодирующими РНК ученые выявили существенную разницу в картине экспрессии. В 15 изученных клеточных линиях информационные РНК, кодирующие белки, гораздо охотнее экспрессировались во всех клеточных линиях, чем длинные некодирующие РНК (см. рис. 14.3). Исследователи пришли к выводу: длинные некодирующие РНК играют определяющую роль в управлении судьбой клеток.

Взятые в совокупности, данные из статей, опубликованных в рамках проекта ENCODE, рисуют картину весьма активного человеческого генома с чрезвычайно сложными схемами взаимодействия и «общения». В сущности, мусорная ДНК набита информацией и инструкциями. Нелишне повторить здесь указания гипотетического режиссера из Введения: «Если вы ставите „Гамлета“ в Ванкувере и „Бурю“ в Перте, в такой-то строке „Макбета“ ударение должно падать на четвертый слог. Если только при этом любительская труппа не ставит „Ричарда III“ в Момбасе, в Кито не идет дождь»10.

Рис. 14.3. Экспрессию генов, кодирующих белки, и генов, не кодирующих белки, проанализировали на примере пятнадцати различных типов клеток. Выяснилось, что гены, кодирующие белки, гораздо чаще экспрессируются во всех типах клеток, чем области, которые вырабатывают молекулы РНК. не кодирующие белки.

Всё это звучит очень вдохновляюще. Почему же тогда многие относятся к значимости этих данных с таким скептицизмом? Отчасти из-за того, что статьи, вышедшие в рамках проекта ENCODE, явили миру очень уж громкие заявления. Самым громким стало утверждение, что целых 80% генома обладают функциями. Проблема в том, что в основе некоторых таких утверждений лежали косвенные измерения самих функций. Особенно это касается исследований, где заключение о наличии функции выводили либо из присутствия эпигенетических модификаций, либо из других физических характеристик ДНК и ассоциированных с ней белков.

Потенциальное против реального

Скептики возражают: эти данные в лучшем случае указывают на то, что исследуемая область потенциально может обладать какой-то функцией. А это слишком туманный признак, и пользы от него ждать не приходится. Представьте себе огромный особняк, владельцы которого впали в нищету, поэтому им отключили электричество за неуплату. Допустим, в здании двести комнат, а в каждой из них — по пять выключателей. Потенциально каждый выключатель может зажечь лампочку, но вполне возможно, что некоторые выключатели вообще никогда не соединялись ни с какими проводами (аристократы не славятся электротехническими талантами), а некоторые лампочки давным-давно перегорели. Сам факт, что на стенах торчат выключатели, которыми можно щелкать туда-сюда, из положения ВКЛ в положение ВЫКЛ и обратно, еще не означает, что при помощи этих устройств действительно удастся изменить уровень освещенности в комнатах.

Возможно, такая же ситуация и у нас в геноме. В нем могут существовать области, несущие на себе эпигенетические модификации или обладающие определенными физическими свойствами. Однако этого недостаточно для того, чтобы показать функциональность этих областей. Не исключено, что эти характеристики возникли просто как побочный эффект чего-то, что происходило поблизости.

Взгляните на любой снимок, запечатлевший Джексона Поллока за созданием его очередного шедевра в жанре абстрактного экспрессионизма11. Скорее всего, вы увидите, что пол в его студии при этом забрызган красками. Но это не значит, что брызги и пятна краски на полу — часть создаваемой картины. И это не значит, что художник сознательно наделил их каким-то смыслом. Они являются просто неизбежным и несущественным побочным продуктом главного события. Возможно, то же самое относится и к физическими изменениям нашей ДНК.

Многие скептически отнеслись к заявлениям участников проекта ENCODE еще и из-за чувствительности использовавшихся методов. В распоряжении ENCODE оказались значительно более чувствительные методы по сравнению с теми, которые применялись, когда наука только начала изучать геном. Это позволило исследователям обнаруживать чрезвычайно малые количества РНК. Критики опасаются, что применявшиеся методы слишком чувствительны и поэтому воспринимали даже фоновый геномный шум. Если вам достаточно много лет и вы еще застали аудиокассеты, вспомните, что происходило, когда вы сильно увеличивали громкость магнитофона. Обычно вы слышали при этом шипяще-свистящий шум на заднем плане. Но этот звук являлся не частью замысла музыкантов, а просто неизбежным побочным продуктом технических ограничений записывающей системы. Критики проекта ENCODE полагают: что-то подобное может происходить и в клетках. Иными словами, не исключена фоновая экспрессия каких-то случайных молекул РНК в активных участках генома. Происходит своего рода утечка РНК. Согласно данной модели клетка не занимается активным включением этих РНК: они просто случайным образом копируются в весьма небольших количествах. Это происходит из-за того, что поблизости идет массированное копирование. Прилив поднимает все лодки, а заодно и все щепки, деревянные обломки и выброшенные пластиковые бутылки, которые окажутся в это время в воде.

Проблема кажется довольно серьезной. Ведь в некоторых случаях исследователи обнаруживали в среднем меньше одной молекулы определенной РНК на одну клетку. Ну да, клетка не может обеспечивать уровень экспрессии какой-то молекулы РНК между нулем и единицей — между уровнем «ни одной копии» и уровнем «одна копия». Отдельная клетка либо вообще не производит никаких копий определенной РНК, либо делает одну ее копию или большее количество таких копий. Всё прочее — гипотетические ситуации типа «чуть-чуть беременна». Вы либо беременны, либо нет, промежуточной ситуации не бывает.

Впрочем, это еще не свидетельство того, что использовавшиеся методы оказались слишком чувствительными. Напротив: можно сделать вывод, что чувствительность наших методов пока недостаточна. Они еще не позволяют нам выделять отдельные клетки и анализировать все молекулы РНК в ней. Вместо этого приходится полагаться на выделение множества клеток, анализ всех имеющихся в них молекул РНК и последующий расчет, сколько молекул РНК в среднем находится в каждой клетке.

Проблема в том, что в результате мы не можем увидеть разницу между ситуацией, когда среди значительной доли клеток в пробе каждая клетка экспрессирует небольшое количество определенной РНК, и ситуацией, когда среди незначительной доли клеток в пробе каждая клетка экспрессирует большое количество определенной РНК. Эти два сценария показаны на рис. 14.4.

Рис. 14.4. Каждый маленький квадратик изображает одну клетку. Цифры в квадратике — число молекул определенной РНК, вырабатываемых этой клеткой. Из-за ограниченной чувствительности методов определения исследователь анализирует целый набор клеток в совокупности. А значит, он может узнавать лишь общее число молекул РНК в этом наборе и не в состоянии провести различие между ситуацией, когда в каждой из 36 клеток содержится по две молекулы РНК (слева), и ситуацией, когда лишь две клетки (из совместно анализируемых 36) содержат по 36 молекул РНК (справа), — или любой другой комбинацией, когда общее число обнаруживаемых таким путем молекул РНК равно 72.

Еще одна трудность состоит в том, что нам нужно убить все клетки, чтобы проанализировать их молекулы РНК. А значит, мы получаем лишь «моментальные снимки» экспрессии РНК, хотя в идеальном случае нам хотелось бы получить что-то вроде фильма, чтобы мы могли увидеть, как протекает экспрессия РНК в режиме реального времени. Эта проблема схематически показана на рис. 14.5.

Разумеется, в идеальном случае мы должны бы иметь возможность проверить находки ENCODE при помощи прямых экспериментов. Но этих находок так много! Как решить, какие именно области или молекулы РНК подвергнуть более пристальному рассмотрению? Еще одна трудность состоит в том, что многие из свойств, выявленных участниками проекта (и описанных ими в статьях), являются частью обширных и сложных сетей взаимодействий. Возможно, каждый компонент оказывает лишь ограниченное влияние на общую картину. В конце концов, если вы разрежете один узел рыболовной сети, вы не нарушите работу сети в целом. Появившаяся дырка, может быть, и позволит случайно ускользнуть какой-то рыбешке, но потеря одной маленькой рыбки не окажет большого влияния на общий размер вашего улова. Однако это не значит, что отдельные узлы не играют важной роли. Все они важны, поскольку действуют сообща.

Рис. 14.5. Экспрессия определенной РНК в клетке может проходить циклически. Квадратики на кривой показывают те моменты, когда экспериментатор отбирает пробы клеток, чтобы измерить экспрессию данной РНК. Результаты могут очень отличаться при сравнении разных наборов клеток (скажем, взятых из разных тканей), но это может отражать лишь колебания во времени (темпоральные флуктуации), а не ка-кие-то биологически значимые вариации.

Эволюционное поле битвы

Авторы работ, проведенных в рамках проекта ENCODE, и авторы сопутствующих комментариев использовали полученные данные и для новых теорий эволюции человеческого генома. Итак, если 80% человеческого генома обладает какими-то функциями, можно ожидать значительного сходства между геномом человека и, по крайней мере, геномами других млекопитающих. Проблема в том, что лишь около 5% человеческого генома — общие для всего класса млекопитающих, причем в основном эти области кодируют белки12. Чтобы преодолеть эту явную нестыковку, ученые предположили, что регуляторные области возникли, по эволюционным меркам, очень недавно, причем главным образом лишь у приматов. Используя данные широкомасштабного исследования вариаций ДНК-последовательности у различных человеческих популяций, исследователи пришли к выводу, что у людей регуляторные области отличаются сравнительно небольшим разнообразием, тогда как у областей, где вообще нет никакой активности, разнообразие гораздо выше. В одном из комментариев дается по этому поводу такое рассуждение. Последовательности, кодирующие белки, в ходе эволюции сохранялись почти неизменными, поскольку тот или иной белок часто используется более чем в одном типе тканей или клеток. Если изменить последовательность, кодирующую белок, изменится и сам белок. Возможно, такой измененный белок будет лучше функционировать в определенной ткани. Однако та же самая трансформация может оказать разрушительное действие на другую ткань, которая также связана с работой данного белка. Поэтому эволюция не трогает последовательность, кодирующую белки.

Но регуляторные РНК не кодируют белки, и их специфичность по отношению к конкретным тканям обычно выше. А значит, они находятся под меньшим эволюционным давлением, поскольку, как правило, лишь один тип ткани основан на работе той или иной регуляторной РНК, к тому же, вероятно, лишь в течение определенных периодов жизни или в ответ на определенные изменения в окружающей среде. Это устранило эволюционные тормоза для регуляторных РНК и позволило нам (в том, что касается этих областей генома) отделиться на эволюционном древе от наших родичей-млекопитающих. Но в человеческих популяциях эволюционное давление заставляет поддерживать оптимальную нуклеотидную последовательность этих регуляторных РНК13.

Биологи, когда дело доходит до научных разногласий, как правило, ведут себя довольно сдержанно. Иногда на какой-нибудь конференции случается агрессивный обмен вопросами и ответами после какого-нибудь доклада, но обычно публичные заявления формулируются аккуратно. Особенно это относится к тому, что публикуется (а не только произносится в ходе выступлений или научных прений). Конечно, все мы владеем искусством читать между строк (см. рис. 14.6), но тексты, предназначенные для печати, обычно характеризуются взвешенным тоном. Вот почему споры вокруг результатов, полученных командой ENCODE, оказались необычайно занимательными для научного сообщества.

Рис. 14.6. В публичных выступлениях ученые часто вежливы (высказывания слева), но иногда их слова — лишь плохо замаскированное неприятие (мысли справа)...

Наиболее откровенные и решительные отклики последовали главным образом от специалистов по эволюционной биологии. И неудивительно. Эволюционные исследования — та часть биологии, где эмоции обычно бурлят сильнее всего. Чаще всего огонь ведется по креационистам, но некоторые пулеметы могут поворачиваться и в сторону других ученых. Эпигенетики, изучающие передачу приобретенных характеристик от родителей потомству, наверняка испытали облегчение, когда ENCODE на некоторое время вывел их из-под обстрела главными силами противника14.

Самый сердитый критический отзыв об ENCODE включал в себя такие милые выражения, как «логическая несостоятельность», «абсурдное умозаключение», «слишком поспешная игра, окончившаяся закономерным проигрышем» и «неправильное использование неправильного определения». На случай, если у читателя все-таки остаются сомнения насчет того, к чему клонят авторы, они завершают статью следующим сокрушительным ударом: «Один из участников проекта предсказал, что результаты, полученные ENCODE, заставят переписать учебники. Что ж, мы согласны. Многие учебники по маркетингу, рекламе в СМИ и пиару, возможно, и в самом деле придется переработать»15.

Основная критика в этом яростном отзыве сосредоточилась на определении того, что такое функция, на том, как участники ENCODE анализировали свои данные, и на выводах насчет эволюционного давления. Первая группа замечаний касается проблем, которые мы уже описывали, используя аналогии с творениями Джексона Поллока. В каком-то смысле эти проблемы во многом вытекают из трудностей, связанных с отделением математики от биологии. Данные ENCODE по большей части интерпретировали сами же участники проекта, используя статистические и чисто математические методы. Скептики утверждают, что это заводит нас в тупик, поскольку при такой интерпретации не учитываются биологические взаимосвязи, а ведь они играют здесь определяющую роль. Приводится очень удачная аналогия. Почему сердце имеет такое важное значение? Потому что это насос, качающий кровь и тем самым разносящий ее по телу. Вот вам биологически важная взаимосвязь. Но если мы проанализируем действия сердца, исходя лишь из полученной математическими методами карты его взаимосвязей с другими компонентами организма, мы придем к смехотворным выводам. В частности, можно решить, что сердце требуется для добавления телу дополнительной массы и для издавания глухого «тук-тук». Нет никаких сомнений, что сердце проделывает и то и другое, но это, честно говоря, не его функция. Это лишь сопутствующие факторы, дополнения к его основной роли.

Критики порицали методы анализа данных, поскольку чувствовали: разные научные группы, входившие в ENCODE, применяли свои алгоритмы по-разному. Одним из следствий этого расхождения стало то, что эффекты, наблюдаемые в каком-то обширном регионе генома, могли иногда восприниматься как неоправданно (и непропорционально) масштабные. К примеру, если блок из 600 пар нуклеотидных оснований классифицировали как функциональный, тогда как на самом деле всю работу выполняли только 10 из этих оснований, это могло сильно исказить определяемую учеными величину процентной доли генома, имеющей какую-то функцию.

Эволюционные возражения сводились к тому, что участники ENCODE игнорировали стандартную модель, согласно которой области с большим количеством вариаций являют собой отражение недостаточного эволюционного отбора, а это, в свою очередь, означает, что они имеют сравнительно небольшое значение. Если вам хочется перевернуть давно укоренившийся в науке принцип, вы должны иметь для этого очень веские основания. Но скептики заявляли: хотя публикации ENCODE содержали невероятное количество данных, в этих работах выводы об эволюции нуклеотидных последовательностей у человека и других приматов делались на основе анализа недопустимо малого числа областей генома.

С обеих сторон приводились интересные научные доводы. Но только лицемеры могли бы заявить, что весь накал страстей вокруг ENCODE возник исключительно по научным причинам. Нельзя игнорировать и другие факторы, самые что ни на есть человеческие. ENCODE стал одним из проявлений Большой науки. А в ней обычно фигурируют огромные международные проекты стоимостью во многие миллионы долларов. Общий научный бюджет не безграничен. Когда средства тратятся на такие инициативы Большой науки, остается меньше финансирования для менее масштабных исследований, в большей степени основанных на гипотезах и предположениях.

Организации, осуществляющие финансирование науки, изо всех сил стараются найти оптимальный баланс между этими двумя типами исследований. Во многих случаях вложения в Большую науку осуществляются при условии, что она генерирует некий ресурс, служащий хорошим стимулом для других ученых. Отличный пример — первое секвенирование человеческого генома (хотя следует признать, что и здесь не обошлось без критики). Но проект ENCODE вызвал противоречивую реакцию не вокруг полученных им «сырых» (исходных) данных, а вокруг их интерпретации. По мнению скептиков, она-то и порождает принципиальное отличие ENCODE от чисто инфраструктурного инвестиционного проекта.

Когда подсчитали, во что обошлись все этапы и аспекты ENCODE, общая сумма оказалась равной примерно четверти миллиарда долларов. Такого количества денег хватило бы по меньшей мере на 600 грантов средних размеров, нацеленных на исследования по проверке отдельных гипотез. Выбирая, как распределять финансирование, нужно стараться поддерживать равновесие, но при таких размерах денежных вливаний вас наверняка ждет раскол в научном сообществе (или хотя бы «глубокая озабоченность», которую высказывают обойденные вниманием и финансированием).

В компании Gartner построили график восприятия новых технологий. Называется он «Цикл шумихи». Поначалу все очень возбуждены: это «пик раздутых ожиданий». Когда же выясняется, что новая технология не способна в одночасье переменить все в вашей жизни, на графике возникает резкий спад (обусловленный крахом иллюзий), и мы скатываемся в «траншею разочарования». В конце концов все успокаиваются, и начинается постепенный и неуклонный рост рационального понимания новой технологии, выводящий на «плато продуктивного отношения».

Для проектов типа ENCODE этот цикл невероятно сжат во времени — из-за резкой поляризации научных групп. Ученые с завышенными ожиданиями действуют одновременно с теми, кто сидит в траншее разочарования. Почти все остальные настроены прагматично и используют результаты ENCODE, когда те могут принести пользу — к примеру, помочь прояснить некий вопрос, волнующий какого-то ученого.

Глава 15. Обезглавленные королевы, странные коты, жирные мыши

Консорциум ENCODE выявил чудовищное изобилие потенциально функциональных элементов в геноме человека. При таком колоссальном количестве трудно выработать разумную стратегию выбора того, с каких областей генома начать экспериментальную проверку этих кандидатов. Однако задача может оказаться не такой тяжелой, как представляется на первый взгляд. Природа, как всегда, словно бы решила сама указать нам путь. В последние годы ученые начали выявлять заболевания человека, причиной которых становятся очень небольшие изменения в регуляторных областях генома. Раньше такие изменения, возможно, просто не рассматривали, считая их безобидными случайными вариациями в мусорной ДНК. Но теперь известно, что в некоторых случаях изменение одной-единственной пары нуклеотидных оснований в (казалось бы) совершенно несущественной области генома способно оказывать заметное воздействие на конкретного человека. А в редких случаях эффект оказывается попросту несовместимым с жизнью.

Начнем с не самого трагического примера. Вернемся вспять на пять веков, во времена, когда Англией правил Генрих VIII. Большинство британских школьников знают полезную считалку, помогающую запомнить, что случилось с шестью женами этого печально знаменитого монарха:

Развод, без головы, скончалась,

Развод, без головы, спаслась.

(Не забудьте прислать мне благодарственный мейл, когда это удобное двустишие поможет вам на какой-нибудь викторине.)

Первой из обезглавленных жен венценосца стала Анна Болейн, мать будущей королевы Елизаветы I. После ее смерти тюдоровские специалисты по работе с общественным мнением запустили грязную кампанию, в результате которой Анна Болейн стала похожа на настоящую ведьму. В описании тогдашних полит-технологов у нее торчащий изо рта зуб, большое родимое пятно под подбородком и шесть пальцев на правой руке. Подробность насчет лишнего пальца ушла в фольклор, хотя достоверных подтверждений этого факта практически нет (а может, их и вовсе не существует)1.

Возможно, одной из причин того, что эту выдумку все-таки приняли на веру, стало то, что она не казалась современникам слишком уж нелепой и смехотворной. Ведь хронисты не утверждали, будто у покойной королевы имелось три ноги. Иногда появляются на свет младенцы с лишними пальцами, хотя обычно у них по шесть пальцев на каждой руке, а не на одной.

В правильном развитии кистей рук и ступней играет важнейшую роль один ген, кодирующий белок[44], который действует как морфоген. Иными словами, он определяет характер развития тканей. Влияние белка сильно зависит от его концентрации. В развивающемся эмбрионе он распределен неравномерно: в одной области его содержание может быть высоким, а в прилегающих тканях — все ниже по мере удаления от этой области.

Перчатки и котятки

Количество пальцев на руках — одна из характеристик, контролируемых этим морфогеном. Если уровни экспрессии данного белка не те, какие надо, ребенок появляется на свет с лишними пальцами. Более десятка лет назад ученые обнаружили, что некоторые случаи излишней многопалости вызваны весьма небольшим генетическим изменением. Оно затрагивает не сам ген, кодирующий морфоген, а участок мусорной ДНК, находящийся примерно за миллион пар нуклеотидных оснований от него. Исследователи выявили это изменение в огромном голландском семействе, где наличие лишних пальцев явно наследовалось из поколения в поколение как генетическая черта. У всех 96 человек, которых затронула эта аномалия, оказалось измененным (точнее, замененным) лишь одно-единственное нуклеотидное основание мусорной ДНК. Вместо основания Ц у этих людей обнаружилось основание Г. При этом среди их родственников с нормальным числом пальцев никто не мог похвастаться наличием основания Г в этой же позиции. Изменения одного нуклеотидного основания также обнаружились у других семей, где отмечались случаи шестипалости. Эти изменения отмечались в том же регионе генома, что и у вышеописанной голландской семьи, но на расстоянии 200-300 пар2.

Мусорный регион, где обнаруживаются эти единичные изменения оснований, — энхансер этого морфогенного гена[45]. Чтобы тело формировалось правильно, осуществляется жесткий пространственный и временной контроль данного морфогена при помощи целого набора регуляторов. У людей с упомянутой мутацией и с лишним пальцем деятельность энхансера, как выяснилось, не совсем соответствовала норме. Влияние этого крохотного изменения на один-единственный регулятор показывает, как тонко настроен механизм контроля и какую важную роль он играет.

Вот вам подсказка для еще одной викторины. Какая связь существует между шестипалыми голландцами, которые испытывают затруднения при покупке перчаток, и одной из величайших фигур в американской литературе XX столетия? Ну? Сдаетесь? Видите ли, в 1930-е годы один капитан подарил Хемингуэю котенка. На передних лапах у него оказалось не по 5 пальцев, а по 6. В доме Хемингуэев теперь живет около 40 потомков этого котенка, и примерно у половины из них 6 пальцев на каждой из передних лап. В Сети полно фотографий этих симпатяг3. Выглядят они одновременно и очень мило, и слегка устрашающе. Лишний отросток напоминает большой палец человеческой руки, и из-за него кошки приобретают какой-то неприятно-пронырливый вид.

Та же научная группа, выявившая изменение в энхансерной области генома шестипалых людей, показала: эта же область изменена и у хемингуэевских кошек. Встраивая данный энхансер в геном другого зверька, они подтвердили, что такое изменение сказывается на экспрессии упомянутого морфогена. У подопытного животного наблюдалась сверхэкспрессия морфогена, и на каждой передней лапе формировался лишний палец. Забавно: эффект продемонстрировали, встроив кошачью ДНК в мышиный эмбрион. Оригинальная игра в кошки-мышки4.

Кошки с избыточным количеством пальцев на передних лапах обнаруживались и в других странах, не исключая и Великобритании. У британских кошек-шестипалок наблюдается изменение в том же энхансере, однако это несколько иное изменение. Оно располагается за две пары нуклеотидных оснований от «хемингуэевского» и затрагивает мотив из трех пар нуклеотидных оснований, сохраняющийся практически неизменным в ходе эволюции. Энхансерная область, влияющая на возникновение лишних пальцев на передних/верхних конечностях кошек и людей, имеет в длину примерно 800 пар нуклеотидных оснований, и основная ее часть почти неизменна на всем протяжении эволюционного древа от рыб до человека. Это заставляет предположить, что система контроля развития конечностей — очень древняя.

Морфогены и развитие лица

Морфоген, отвечающий за формирование пальцев, играет важнейшую роль и в других процессах развития. Среди них — формирование структуры лица и передней части мозга. Эффект каких-то нарушений здесь может оказаться сравнительно слабым, приведя всего лишь к возникновению заячьей губы. Однако при более серьезном нарушении экспрессии данного морфогена лицо и мозговые структуры будут складываться совершенно аномальным образом. В наиболее острых случаях младенцы появляются на свет с единственным глазом, который к тому же расположен посреди лба, и в их мозге присутствуют опаснейшие дефекты. Такие дети не выживают.

Весь этот спектр симптомов описывается как проявление болезни, именуемой голопрозэнцефалией5. Показано, что в семьях, где наблюдается этот недуг, мутации подверглись разные гены, кодирующие белки. Многие из этих генов участвуют в процессах регуляции морфогена, который требуется для нормального пальцеобразования. В отдельных случаях мутирует сам ген, кодирующий белок-морфоген. Развивающийся эмбрион вырабатывает лишь половину нормального количества морфогена, поскольку функционирующий белок синтезируется лишь одной хромосомой, а не двумя. Аномалии, наблюдаемые у больных этим недугом, показывают: очень важно, чтобы уровни содержания морфогена достигали определенных пороговых значений в ключевые моменты развития эмбриона.

Не все мутации, вызывающие голопрозэнцефалию, удалось идентифицировать. Специалисты изучили ДНК примерно 500 страдающих этим заболеванием. Они обнаружили неожиданное изменение в одной из областей мусорной ДНК у одного младенца с острой формой этой болезни. Речь идет об изменении единственного основания (с Ц на Т) в области, которую отделяют от упомянутого морфогенного гена более чем 450 тысяч пар нуклеотидных оснований6.

Эта замена Ц на Т произошла в блоке из 10 пар нуклеотидных оснований, который не менялся очень долго, с тех пор, как наши давние предки отделились от предков лягушек более 350 миллионов лет назад. А значит, можно заключить, что этот «мусорный» фрагмент, явно имеет какую-то функцию. В данном энхансере основание Ц связывает белок, служащий транскрипционным фактором[46]. Транскрипционные факторы — белки необычные: они умеют распознавать определенные ДНК-последовательности (обычно в промоторах) и связываться с ними. Связывание транскрипционных факторов с промотором играет важнейшую роль при включении гена. Ключевой транскрипционный фактор для энхансера может соединяться с упомянутым мотивом из 10 пар нуклеотидных оснований, когда ДНК содержит Ц в нужном положении — но не когда в этом положении оказывается основание Т.

Такая замена Ц на Т, происходящая в данном энхансере, не наблюдалась в контрольной группе из 450 здоровых добровольцев. Вполне возможно, что именно это изменение стало причиной проблем у пациента, о котором шла речь выше. Однако важно помнить, что оно наблюдалось лишь один раз среди примерно такого же количества пациентов, страдающих этим заболеванием. Болезнь не коснулась матери ребенка. Как и ожидалось, в обеих хромосомах матери основание Ц занимало свое нормальное положение. Как ни странно, у отца младенца имелась такая же генетическая последовательность в данном энхансере, как и у ребенка. Иными словами, в одной хромосоме на обсуждаемом нами месте находилось основание Ц, а в другой — основание Т. Однако отец ребенка не демонстрировал никаких симптомов голопрозэнцефалии.

Это может показаться сильным доводом против гипотезы о значимости замены Ц на Т, но ситуация не настолько очевидна. У членов семьи, где наблюдается голопрозэнцефалия, часто проявляются немалые различия в симптомах, даже если вызвавшая их мутация затронула сам морфогенный ген. До 30% членов семей, где наблюдается такая мутация, не демонстрируют вообще никаких симптомов данной болезни, а у остальных симптомы могут быть весьма различны в зависимости от конкретного больного. Первая ситуация называется вариабельным проникновением, а вторая — вариабельной экспрессивностью.

К сожалению, это классические примеры того, как биологи идентифицируют явление, дают ему красивое название и перестают о нем думать. Да, ученые описали наблюдаемые явления при помощи тех фраз, которые приведены выше. Только вот пока не очень-то понятно, почему это происходит. В этой удивительной сфере мы пока еще разбираемся слабо. Возможно, существуют другие тонкие геномные вариации, компенсирующие у некоторых людей влияние таких изменений ДНК. Возможно, при таких вариациях активизируются другие энхансеры, тем самым резко усиливая экспрессию морфогена. Возможно, у некоторых людей происходит и своего рода эпигенетическая компенсация, как бы подталкивающая экспрессию ключевых генов в нужном направлении. А возможно, речь идет о комбинации перечисленных факторов — и других, которые мы пока не выявили.

Однако если мы имеем дело с неопределенной ситуацией такого рода (один из родителей и ребенок имеют одно и то же генетическое изменение, но проявляют разные симптомы), жизненно необходимо выстроить дополнительные линии доводов в поддержку любой гипотезы, касающейся влияния такой замены нуклеотидного основания. Исследователи, выявившие замену Ц на Т в энхансере, именно это и проделали. Они проверили эффект замены на мышах. Удалось показать: когда Ц находится в упомянутом положении, соответствующий участок мусорной ДНК действует как энхансер экспрессии морфогена. Но когда на смену Ц приходит Т, эта область больше не действует как энхансер, и содержание данного морфогена в мозгу так и не достигает нужного уровня.

Морфогены и поджелудочная железа

Участие морфогена в формировании лишних пальцев или в развитии всевозможных форм голопрозэнцефалии — не единственный пример, когда причиной какого-то заболевания человека становится изменение в регуляторной области ДНК. Вот, к примеру, панкреатический агенез — болезнь, при которой поджелудочная железа развивается неправильно. У детей, родившихся с этим заболеванием, часто наблюдаются острые формы диабета7. Дело в том, что именно поджелудочная железа вырабатывает инсулин — гормон, позволяющий нашему организму регулировать уровень сахара в крови.

В большинстве семей, где наблюдается панкреатический агенез, отмечается мутация одного определенного транскрипционного фактора[47],8, но у некоторого количества таких семей мутирует другой транскрипционный фактор[48],9. Однако известно много случаев, когда ребенок рождается с необъяснимым панкреатическим агенезом (то есть никого среди его родных это заболевание не коснулось). Как правило, мы считаем, что такие ситуации возникают случайно: может быть, вследствие какого-то нарушения развития, вызванного реакцией организма на воздействие не опознанного нами фактора среды. Но постепенно стало очевидно, что большинство таких ситуаций (казавшихся спорадическими) возникает в семьях, где родители больного ребенка являлись родственниками друг друга (обычно — двоюродным братом и сестрой). Значит, мы имеем дело с близкородственным браком и так называемым генетическим родством. Когда генетическое родство связано с повышенным уровнем заболеваемости наследственными недугами, мы обычно ищем какое-то генетическое изменение, причем такое, при котором обе копии хромосомы несут на себе одну и ту же вариацию. Причины, по которым такие заболевания более распространены у детей, рожденных в близкородственном браке, схематически показаны на рис. 15.1.

Рис. 15.1. Вверху показано, что для носителя редкой генетической мутации сравнительно мала (со статистической точки зрения) вероятность встретить другого носителя такой же мутации среди населения в целом. Однако в собственной семье куда вероятнее повстречать человека, который тоже унаследовал эту мутацию (ситуация проиллюстрирована внизу). Вот почему редкие рецессивные заболевания (такие, при которых каждый из родителей является бессимптомным носителем одного мутантного гена) встречаются чаще, когда родители пациента — близкие родственники (скажем, двоюродные брат и сестра).

Исследователи выделили ДНК пациентов со спорадической формой панкреатического агенеза и проанализировали все области, кодирующие белки. Им не удалось отыскать вариации в ДНК-последовательности, которые послужили бы объяснением данного заболевания. Поэтому они обратились к предсказанным регуляторным областям. Мы уже знаем, что таких областей в человеческом геноме несметное количество. Чтобы сузить зону поисков, ученые решили выяснить, что происходит, когда культивируемые в лаборатории стволовые клетки превращаются при дифференциации в клетки поджелудочной железы. Исследователям хотелось найти регуляторные области, которые несут в себе эпигенетические модификации, обычно ассоциируемые с функционированием энхансеров, а, кроме того, связывающие транскрипционные факторы, которые (как удалось предварительно установить) играют важную роль в развитии клеток поджелудочной железы.

Это сузило список участков-кандидатов всего до 6 тысяч с небольшим. Такое количество куда легче подвергнуть углубленному анализу. Оказалось, что у 4 пациентов А меняется на Г в предполагаемом энхансере — области из примерно 400 пар нуклеотидных оснований, располагающейся на хромосоме 10. Эта область размещается в 25 тысячах парах нуклеотидных оснований от одного из транскрипционных факторов, который (как опять-таки предварительно установили) мутирует у небольшой доли семей, страдающих панкреатическим агенезом. У 7 из 10 пациентов, не связанных близким родством, наблюдалось одно и то же изменение: энхансер на обеих копиях хромосомы 10 имел основание Г там, где обычно располагается основание А. При этом у восьмого и девятого пациентов мутации располагались поблизости от этого места, а десятый вообще, как выяснилось, утратил этот энхансер. Проанализировали также геном приблизительно 400 человек, которых не коснулось данное заболевание. Ни у кого из них не обнаружилось такой замены А на Г.

 Исследователи показали, что область, которую они выявили, действует как энхансер в развивающихся панкреатических клетках — и что данная область перестает служить энхансером, когда в определенной позиции основание А в ней меняется на основание Г. Затем, в ходе дальнейших экспериментов, они стали изучать, как данный энхансер влияет на свой ген-мишень. Это влияние схематически показано на рис. 15.2. ДНК-последова-тельность образует петлю, тем самым приближая энхансер к гену-мишени. Обычно этот энхансер соединяется с транскрипционными факторами, которые помогают включать ген-мишень. Но транскрипционные факторы связываются лишь с определенными ДНК-последовательностями. Когда основание А меняется на основание Г, транскрипционные факторы не могут соединяться с этим участком, а значит, не могут и включать ген-мишень10.

Рис. 15.2. I: расположение энхансера, промотора и тела гена на ДНК-последовательности. II: ДНК образует складку, приближая энхансер к промотору. Когда энхансер содержит в определенной позиции нуклеотидное основание А, он может присоединять к себе определенные белки из числа транскрипционных факторов. Эти белки, в свою очередь, могут активировать промотор и включать ген. III: вместо основания А в той же позиции энхансера находится основание Г, с которым эти транскрипционные факторы связываться не могут. Следовательно, они не могут активировать промотор, и ген не включается.